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蜂王浆(royal jelly)是哺育工蜂头部王浆腺的分泌物,是1-3龄工蜂幼虫及蜂王的终生食料,有着众多的营养保健和生理活性功能。蜂王浆的神奇功效与它所具有的活性成分密不可分。蜂王浆化学成分极为复杂,其中蛋白质是主要营养成分,含量约占王浆干物质的50%,分为可溶性及不可溶性两大类,可溶性蛋白占王浆总蛋白的82—90%,被称为主要王浆蛋白MRJPs(majorroyal jelly proteins)。其中MRJP1是MRJPs含量最丰富,也是目前研究最多的蛋白。它是一个56KD-57KD的糖蛋白,占MRJPs的48%,被认为是与王浆酸同样重要的王浆质量指标和功效成分,有着重要研究价值。本研究首先根据中华蜜蜂(A.cerana cerana)MRJP1(下称AccMRJP1)序列,从已完成表达序列标签(Expressed Sequence Tags,EST)测序的蜂脑cDNA文库选出3个AccMRJP1克隆,通过PCR检测和测序筛选获得一个cDNA全长为1302bp、可编码433个氨基酸残基的AccMRJP1开放阅读框架(Open Reading Frame,ORF),该氨基酸序列与已报道的AccMRJP1编码序列(GenBank登录号:AY279539)的同源性为99.8%。其次,将AccMRJP1基因克隆到原核和真核表达载体并实现了其在大肠杆菌及甲醇毕赤酵母中的表达。将该AccMRJP1基因克隆到表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21(Escherichiacoli BL21)中进行融合表达。SDS-PAGE电泳分析显示一条分子量大小约76 kDa,占细胞总蛋白的17.7%特异性条带;以GST多抗为一抗作Western blot分析,检测到AccMRJP1与GST的融合表达蛋白印迹,并通过亲和柱分离获得了纯化的表达产物,证明AccMRJP1基因在大肠杆菌中已表达成功。构建了AccMRJP1/pPIC 9K真核表达载体,电转化到甲醇毕赤酵母菌GS115(Pichia pastoris GS115)中进行表达。SDS-PAGE电泳分析表明,表达的产物在58 KDa处出现特异性条带,分别以His单抗和AccMRJP1多抗为一抗作Western blot检测,检测到表达蛋白印迹,说明AccMRJP1基因在酵母菌中也已表达成功。此外,还利用AccMRJP1原核表达表达产物作抗原免疫家兔,获得兔抗AccMRJP1的多克隆抗体,效价高达1.6×10~4,为MRJPs家族其他成员及其基因产物的检测提供了一个有效手段。最后,用硫酸铵沉淀法分离了AccMRJP1表达产物,对昆虫细胞Tn-5B1-4生长影响进行了研究。实验表明,AccMRJP1具有一定的营养功能,可以促进细胞的生长,有可能代替牛血清在细胞培养中发挥作用。本实验成功构建了AccMRJP1原核及真核表达载体,制备了AccMRJP1多克隆抗体,为发酵法规模性生产AccMRJP1、重组蛋白活性的研究及MRJPs家族成员及其基因产物的检测奠定了基础,纯化的AccMRJP1产物可促进细胞生长,有可能代替牛血清在细胞培养中发挥作用,具有重要的研究价值和应用前景。