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研究目的：检测Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(Type II cGMP-dependent protein kinase,PKG Ⅱ)在癌细胞株和胃癌组织中的表达,明确PKG II对溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)引起的胃癌细胞迁移的影响,阐明PKG Ⅱ对LPA诱导的迁移相关小G蛋白RhoA & Rac1活化的作用机制。研究方法：(1)采用RT-PCR的方法,检测PKG Ⅱ在胃癌细胞株、乳癌细胞株、肾癌细胞株及对应上皮细胞株中的表达；采用荧光定量PCR的方法,检测PKG Ⅱ在胃癌组织中的表达；用Wilcoxon Signed Ranks Test分析PKG Ⅱ在胃癌组织及对应癌旁组织中的差异；用Mann-Whitney U test 或 Kruskal-Wallish test分析PKG Ⅱ表达和胃癌患者临床参数的相关性。(2)通过感染编码PKG ⅡcDNA的腺病毒Ad-PKG Ⅱ,增加胃癌细胞AGS和HGC-27内PKG Ⅱ的表达。以8-pCPT-cGMP特异性激活胃癌细胞或胃黏膜上皮细胞内的PKG ⅠⅠ,再加入LPA,采用Transwell迁移实验分析细胞的迁移活动；采用荧光染色法检测细胞内应激纤维的变化；采用pull-down法、Western blotting检测小G蛋白RhoA和Rac1的活性变化；采用Western blotting检测MAPK/ERK通路和PI3K/Akt通路中相关信号分子的活性；采用IP和Western blotting方法检测PKG Ⅱ对EGFR的酪氨酸磷酸化作用。(3)构建质粒pFlag-RhoA、 pFlag-RhoA188A和 pFlag-Rac1,分别转染胃癌细胞AGS和HGC-27,再感染腺病毒Ad-LacZ或Ad-PKG Ⅱ并以8-pCPT-cGMP特异性激活PKG Ⅱ,采用IP和Vestern blotting方法检测PKG Ⅱ对小G蛋白RhoA及Rac1的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的作用。(4)胃癌细胞AGS感染腺病毒Ad-LacZ或Ad-PKG Ⅱ,并以8-pCPT-cGMP特异性激活PKG Ⅱ,采用Co-IP方法检测PKG Ⅱ与RhoA的相互结合；构建质粒pBiFC-RhoA-VC和pBiFC-PKG Ⅱ-VN,并共转染COS-7细胞,利用双分子荧光互补实验检测活细胞内PKG Ⅱ与 RhoA的结合情况；构建PKG Ⅱ与RhoA不同域段的原核表达载体,并转化大肠杆菌、表达相应蛋白,用pull-down法检测PKG Ⅱ各缺失型突变体与RhoA的结合以及RhoA各缺失型突变体与PKG Ⅱ的结合。(5)将MAPK/ERK通路、PI3K/Akt通路和PLC/IP3/DAG通路的抑制剂分别作用胃癌细胞AGS和HGC-27,采用pull-down法、Western blotting检测小G蛋白RhoA和Rac1的活性变化。(6)将EGFR的抑制剂作用于胃癌细胞AGS和HGC-27,再加入LPA,采用pull-down法、Western blottin g检测小G蛋白Racl和RhoA的活性变化,用Western blotting检测MAPK/ERK通路和PI3K/Akt通路中相关信号分子的活性。研究结果：(1)在人胃黏膜上皮细胞、人乳腺上皮细胞和人胚肾上皮细胞中,人胃黏膜上皮细胞株GES-1的PKG Ⅱ含量最高；在上述三组不同组织来源的上皮细胞及对应癌细胞株中,人胃黏膜上皮细胞株GES-1与胃癌细胞株之间的PKG Ⅱ表达差异最为明显；在74例胃癌组织标本中,49例癌组织PKG Ⅱ的表达低于癌旁组织(P<0.05),占总例数的66.2%(49/74),但与临床病理参数无显著相关性。(2)活化的内源性PKG Ⅱ可以抑制由LPA诱导的人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞的迁移；活化的外源性PKG Ⅱ可以抑制由LPA诱导的人胃癌细胞株AGS和HGC-27细胞的迁移及细胞骨架的形成。(3)活化的外源性PKG Ⅱ可以抑制LPA对小G蛋白RhoA的激活；PKG Ⅱ可使RhoA发生丝氨酸和苏氨酸磷酸化,188丝氨酸位点是PKG Ⅱ磷酸化RhoA的特异性位点；PKG Ⅱ可与RhoA发生结合,且结合部位为PKG ⅡⅡ的氨基段和RhoA的氨基段。(4)活化的外源性PKG Ⅱ可以抑制LPA对小G蛋白Racl的活性,但不能使Rac1发生明显的磷酸化；PKG Ⅱ可以通过降低LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化,及其下游的MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路,进而抑制LPA引起的小G蛋白Rac1的活化。结论：PKGⅡ在人胃癌细胞中的表达低于胃黏膜上皮细胞,在胃癌组织中的表达低于癌旁组织；内外源性PKG Ⅱ活化后可分别抑制LPA诱导的人胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞的迁移；PKG Ⅱ可以抑制LPA引起的迁移相关小G蛋白RhoA和Rac1活化；PKG Ⅱ通过与RhoA结合使其发生188位丝氨酸磷酸化；PKG Ⅱ通过抑制LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化(活化),及其下游MAPK-ERK和PI3K-Akt通路的信号转导,进而抑制Rac1的活性。