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大肠杆菌是一类普遍存在于动物肠道的革兰氏阴性菌,可分为共生型、腹泻型和肠外致病型。腹泻型和肠外致病型又统称为致病性大肠杆菌,是重要的食源性致病菌。据估计,致病性大肠杆菌在美国每年可造成26万人感染,3600人住院和数十亿美元的相关医疗费用,也是引起我国儿童腹泻的主要原因。抗生素治疗和化学消毒是防治食源性致病菌最有效的方法。然而,抗生素和化学消毒剂的大量使用导致了耐抗生素和耐消毒剂菌株的出现和传播。因此,寻找应对食源性致病菌的新方法是一个必要且紧迫的任务。噬菌体治疗是一种借助噬菌体自身生长繁殖消灭宿主菌的杀菌机制,是防控致病性大肠杆菌的最佳选择之一。然而研究表明大肠杆菌噬菌体具有裂解谱窄的特点,对于血清型众多的致病性大肠杆菌作用有限,这在一定程度上限制了大肠杆菌噬菌体的临床应用。本研究旨在建立筛选广谱性噬菌体的方法,筛选能裂解多种致病型大肠杆菌的广谱性噬菌体,并评估在牛奶,鸡肉,猪肉,生菜样品中的抑菌效果,为有效防控食源性致病性大肠杆菌提供备选方案。建立的筛选方法还可以用于筛选其他食源性致病菌的广谱噬菌体,对推进噬菌体治疗在食品工业的发展具有重要意义。具体研究结果如下:1.分离大肠杆菌,筛选广谱噬菌体本研究从我国9个省24个市的畜禽养殖场共收集71份污水样品,从中分离了146株大肠杆菌用于广谱噬菌体的筛选。筛选方法如下:将71份污水样品混合,首先用4株非致病性大肠杆菌的混合培养物增殖样品中的噬菌体,然后用增殖后的噬菌体混合物分别感染200株大肠杆菌并测定每株产生子代噬菌体的效价,根据效价将能被噬菌体感染的184株排序并随机分成4组。广谱噬菌体的筛选流程以第1组为例:以非致病性大肠杆菌增殖得到的噬菌体混合物感染组内排序第1的菌株,得到的噬菌体再感染排序第2的菌株,得到的噬菌体再感染排序第3菌株,直到感染完组内所有大肠杆菌,从最后的平板上随机挑取1个噬菌斑。本研究共筛得4株广谱噬菌体:EPEC 133 phage、STEC 65 phage、STEC 60 phage、EPEC 66 phage。随机挑选的100株大肠杆菌验证4株噬菌体的广谱性,结果显示EPEC 133 phage、STEC 65 phage、STEC 60 phage、EPEC 66 phage 及 Phage cocktail（4 株噬菌体的混合物）能感染14、17、9、21、31株,说明筛选的噬菌体具有一定的广谱性。2.广谱性噬菌体特性分析本研究从形态学,生物学,基因组学3个方面对噬菌体特征进行了分析。形态学分析:对4株噬菌体进行透射电镜观察,结果显示4株噬菌体均为有尾噬菌体,其中EPEC 133 phage和STEC 65 phage为肌尾噬菌体,STEC 60 phage为长尾噬菌体,EPEC 66 phage为短尾噬菌体。生物学分析:为测定噬菌体稳定性,将4株噬菌体在不同温度和pH环境中处理1 h,结果显示4株噬菌体在4～60℃和pH 4～10的条件下均能稳定存活,表明噬菌体具有临床应用所需的稳定性。为定量描述噬菌体增殖效率,进行了一步生长曲线测定,结果显示 EPEC 133 phage、STEC 65 phage、STEC 60 phage、EPEC 66 phage的爆发量分别约为81、79、98、84个噬菌体/细胞。表明这些噬菌体均具有高效的增殖能力,能大规模生产。为测定4株噬菌体对细菌的裂解特性,分别对4株噬菌体进行裂解曲线的测定。结果显示MOI越大时,噬菌体完全裂解细菌的时间越短,且当MOI=5时,4株细菌均能够在1小时内被完全裂解。基因组学分析:为评估4株噬菌体是否带有毒力基因、耐药基因、溶原性基因,我们提取了噬菌体的基因组,送往公司进行二代测序。结果显示所筛选的噬菌体均不携带毒力基因、耐药基因及溶原性基因。实验表明这些噬菌体临床应用时不会引起上述基因的水平转移。3.广谱性噬菌体的应用为进一步评估4株噬菌体在食品中的抑菌效果,将4株噬菌体混合成鸡尾酒噬菌体,分别以MOI=1000和MOI=10000接种至29种大肠杆菌混合物处理过的牛奶、鸡肉、猪肉、生菜样品中。分别在接种后3h,6h,12h统计细菌数量。结果显示在牛奶样品中,实验组（MOI=1000和MOI=10000）与阴性对照组（PBS）相比均有较强的抑菌效果,实验组之间抑菌效果无显著差异,但在3～12h范围内随着时间延长菌量有所增加。在鸡肉,猪肉和生菜样品中,噬菌体处理组与对照组相比也有较强的抑菌作用,实验组间抑菌效果无显著差异,且在3～12h范围内能持续杀菌。本研究所筛选的4株大肠杆菌广谱噬菌体（EPEC 133 phage、STEC 65 phage、STEC 60 phage、EPEC 66 phage）能感染随机挑选的100株大肠杆菌中的31株,具有广谱性,广谱噬菌体筛选方法构建成功。4株广谱噬菌体形态多样,种类各不同,不含毒力基因,致病基因,溶源性基因,其组成的鸡尾酒噬菌体在牛奶、鸡肉、猪肉、生菜食品中能有效杀菌。