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研究背景烟曲霉(Aspergillus fumigatus, A. fumigatus)是一种常见的腐生型真菌,通常以孢子的形式广泛存在于我们周围环境中,正常人体每天都会吸入少量的孢子。对于免疫功能正常的人群来说,吸入的烟曲霉孢子能够及时被肺部免疫系统有效识别并清除,从而避免了疾病的发生。但是,对于免疫抑制的人群来说,吸入烟曲霉孢子则可能会导致多种类型的感染性疾病,如侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、曲霉球(aspergilloma)和变应性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA)等。其中,IPA是一种致命性的烟曲霉感染,主要发生于艾滋病、肿瘤化疗、糖皮质激素治疗、造血干细胞移植或实体器官移植等免疫抑制的人群。近年来,随着免疫抑制人群数量的增加,IPA的发病率和死亡率逐年升高。并且,尽管真菌感染的诊断技术和治疗手段发展迅速,IPA患者的病死率仍然很高,预后仍然很差。因此,更好的了解宿主对抗烟曲霉感染的免疫防御机制,能够为IPA的防治提供新的思路和手段。天然免疫系统是宿主抵抗入侵病原体的第一道防线,肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMs)是肺部最重要的天然免疫细胞,它能够通过其表面的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)特异性的识别真菌细胞壁的病原体分子相关模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),启动天然免疫反应。其中,树突状细胞相关C型凝集素受体-1(dendritic cell-associated C-type lectin receptor, Dectin-1)、Toll样受体-2(toll-like receptor, TLR-2)和TLR-4是研究最多的参与烟曲霉感染的PRRs,它们能够识别烟曲霉细胞壁的不同成分,介导巨噬细胞吞噬和杀灭入侵的烟曲霉孢子,释放促炎因子和趋化因子等,并进一步激活宿主的适应性免疫反应,增强宿主对入侵烟曲霉的杀灭和清除能力。研究证实,无论在人类还是小鼠,Dectin-1、TLR-2和TLR-4基因沉默或敲除后,宿主对烟曲霉的易感性明显升高,并且具有较低的炎症因子水平和较高的组织真菌负荷,而基因敲除的小鼠死亡率也明显升高。因此,Dectin-1、TLR-2和TLR-4在抗烟曲霉天然免疫反应中发挥着至关重要的作用。转录因子PU.1是ETS(E26-transformation-specific)家族的重要成员之一,对于人类,它主要由脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene-1,SPI1)基因编码。研究发现,PU.1的主要功能是参与造血系统的分化和发育。但越来越多的研究证实,PU.1能够参与宿主天然免疫和适应性免疫反应。在成熟的巨噬细胞中,PU.1能够结合某些重要基因的启动子区域,在转录水平调控它们的表达,包括Dectin-1、TLR-2和TLR-4,但是在翻译水平和他们的功能方面研究较少。因此,鉴于Dectin-1、TLR-2和TLR-4在烟曲霉感染中的重要作用和PU.1对它们的调控作用,我们设想,高表达或沉默PU.1能够影响宿主细胞抗烟曲霉感染的天然免疫作用。本研究使用人急性单核细胞白血病单核细胞株(human acute monocytic leukemia cell line, THP-1)经佛波酯(phorbolmyristate acetate, PMA)诱导贴壁,获得了体外AMs细胞模型THP-1巨噬细胞。并通过PU.1基因重组腺病毒(recombinant adenovirus, Ad-PU.1)和PU.1小干扰RNA(small interfering RNA, PU.1 siRNA)成功构建了PU.1高表达和沉默的THP-1巨噬细胞模型,并进一步验证了干预PU.1后,THP-1巨噬细胞抵抗烟曲霉感染的天然免疫功能的变化。第一章构建并鉴定PU.1高表达或沉默的THP-1巨噬细胞模型目的分别使用Ad-PU.1和PU.1 siRNA体外转染THP-1巨噬细胞,并进一步研究PU.1干预后Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表达变化。方法①使用携带绿色荧光蛋白基因的空病毒载体(adenovirus vector containing enhanced green fluorescent protein gene, Ad-EGFP)分别以感染复数(multiplicity of infection, MOI)等于500,1000,1500和2000转染THP-1巨噬细胞,荧光显微镜观察转染24 h、48 h和72 h后的绿色荧光蛋白表达情况,来确定腺病毒载体的最佳MOI值;②使用Ad-PU.1以最佳MOI值转染THP-1巨噬细胞(Ad-PU.1组),设未转染细胞组(Mock组)和转染空病毒(adenovirus vectors,Ad)细胞组(Ad组)作为对照组。转染48 h后分别提取细胞总RNA和总蛋白,通过Real-time PCR、Western blot方法分别在基因mRNA和蛋白水平检测PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表达变化；③使用PU.1 siRNA体外转染THP-1巨噬细胞(siPU.1组),分别设未转染细胞组(Mock组)和转染阴性对照小干扰RNA(small negative control siRNA, PU.l siNC)的细胞组(siNC组)作为对照组。48 h后分别提取细胞总RNA和总蛋白,通过Real-time PCR、Western blot方法分别在基因mRNA和蛋白水平检测PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表达变化。结果①使用Ad-EGFP以MOI=1500转染THP-1巨噬细胞48 h后,绿色荧光最强,且在转染72 h后,仍可观察到较强的绿色荧光；②使用Ad-PU.1(MOI=1500)转染THP-1巨噬细胞48 h后,Ad-PU.1组的PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4mRNA分别较Mock组升高了80.39倍(p<0.001)、8.31倍(p<0.01)、2.56倍(p<0.001)和4.28倍(p<0.05),较Ad组分别升高了51.6倍(p<0.001)、3.05倍(p<0.05)、2.26倍(p<0.001)和2.92倍(p<0.05),差异均具有统计学意义；③使用PU.1 siRNA转染THP-1巨噬细胞48 h后,siPU.1组的PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4 mRNA表达量分别为Mock组的19.0%(p<0.001)、53.7%(p<0.01)、59.7%(p<0.01)和56.6%(p<0.05)、是siNC组的17.7%(p<0.001)、47.1%(p<0.01)、64.4%(p<0.05)和61.2%(p<0.05),差异均具有统计学意义。此外,PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4在蛋白水平上均有不同程度的变化,且与它们对应的基因mRNA表达变化趋势相同。结论PU.1高表达和沉默的THP-1巨噬细胞模型构建成功。高表达PU.1能够引起Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表达升高,而沉默PU.1能够降低三者的表达。第二章PU.1高表达的THP-1巨噬细胞在烟曲霉感染中的作用目的通过Ad-PU.1体外转染THP-1巨噬细胞,探讨高表达PU.1对THP-1巨噬细胞抗烟曲霉感染能力的影响。方法①使用Ad-PU.1体外转染THP-1巨噬细胞(Ad-PU.1组),分别设置未转染细胞组(Mock组)和转染Ad的细胞组(Ad组)作为对照组。转染48 h后,用静息期的烟曲霉孢子刺激Oh、4h、8h和12 h,分别提取对应时间点的细胞总RNA,并收集各个对应时间点的细胞培养上清。Real-time PCR法检测0 h、4 h、8 h和12 h的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10mRNA的表达,ELISA法检测4 h、8 h和12 h的细胞培养上清中TNF-a和IL-10的含量；②使用Ad-PU.1体外转染THP-1巨噬细胞(Ad-PU.1组),设置未转染细胞组(Mock组)和转染Ad的细胞组(Ad组)作为对照组。转染48 h后,使用绿色荧光染料(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的静息期烟曲霉孢子刺激4 h后,分别对细胞膜和细胞核进行染色处理,通过激光共聚焦显微镜观察细胞对烟曲霉孢子的吞噬能力；③使用Ad-PU.1体外转染THP-1巨噬细胞(Ad-PU.1组),设未转染细胞组(Mock组)和转染Ad的细胞组(Ad组)作为对照组。转染48 h后,用静息期烟曲霉孢子分别刺激0 h、4 h和8 h,通过平板菌落试验观察THP-1巨噬细胞对烟曲霉孢子的杀灭能力。结果①在烟曲霉孢子刺激48 h后,Real-time PCR法检测发现Ad-PU.1组中的TNF-α和IL-1β mRNA表达量较对照组(Mock组和Ad组)明显升高,差异具有统计学意义,但IL-10 mRNA的表达较对照组差异无统计学意义；ELISA法检测发现,经过烟曲霉孢子刺激后,Ad-PU.1组细胞培养上清中的TNF-α和IL-1β浓度较对照组明显升高,差异具有统计学意义,而IL-10的水平与对照组相比差异无统计学意义；②激光共聚焦显微镜结果证实,与对照组相比,PU.1高表达的THP-1巨噬细胞对FITC标记的烟曲霉孢子的吞噬能力明显增强；③平板菌落试验也进一步证实,高表达PU.1能够增强THP-1巨噬细胞对烟曲霉孢子的杀灭能力。结论在烟曲霉感染过程中,PU.1高表达的THP-1巨噬细胞能够释放更多的炎症因子TNF-a和IL-1p,而抗炎因子IL-10表达无明显变化。并且,高表达PU.1能够增强THP-1巨噬细胞对烟曲霉孢子的吞噬和杀灭能力。第三章PU.1沉默的THP-1巨噬细胞在烟曲霉感染中的作用目的通过PU.1 siRNA体外转染THP-1巨噬细胞,探讨沉默PU.1对THP-1巨噬细胞抗烟曲霉感染能力的影响。方法①使用PU.1 siRNA体外转染THP-1巨噬细胞(siPU.1组),同时设未转染的细胞组(Mock组)和转染阴性小干扰RNA(negative control siRNA, siNC)的细胞组(siNC组)作为对照组。转染48 h后,分别用静息期烟曲霉孢子刺激0 h、4 h、8 h和12 h,分别提取对应时间点的细胞总RNA,并收集各个对应时间点的细胞培养上清。Real-time PCR法检测0 h、4 h、8 h和12 h的炎症因子TNF-α、IL-1p和IL-10 mRNA的表达变化,并使用ELISA法分别检测4 h、8 h和12 h的细胞培养上清中TNF-a和IL-10的含量；② PU.1 siRNA体外转染THP-1巨噬细胞(siPU.1组),同时设未转染的细胞组(Mock组)和转染siNC的细胞组(siNC组)作为对照组。使用FITC标记的静息期烟曲霉孢子刺激4 h后,分别使用细胞膜染料Dil和细胞核染料DAPI对细胞进行染色处理,激光共聚焦显微镜观察THP-1巨噬细胞对烟曲霉孢子的吞噬情况；③ PU.1 siRNA体外转染THP-1巨噬细胞(siPU.1组),同时设未转染的细胞组(Mock组)和转染siNC的细胞组(siNC组)作为对照组。用静息期的烟曲霉孢子刺激0 h、4 h和8 h后,通过平板菌落试验观察细胞对烟曲霉孢子的杀灭能力。结果① Real-time PCR法检测发现,在烟曲霉孢子刺激后,siPU.1组的TNF-α和IL-1β mRNA表达水平较对照组(Mock组和siNC组)显著降低,而IL-10mRNA的表达量较对照组升高,差异均具有统计学意义;ELISA法检测发现,经过烟曲霉孢子刺激后,siPU.1组的细胞培养上清中TNF-α水平较对照组降低,但IL-10的表达明显升高,差异均具有统计学意义；②沉默PU.1后,激光共聚焦显微镜观察到THP-1巨噬细胞对FITC标记的烟曲霉孢子的吞噬能力较对照组明显增强。③平板菌落试验也进一步证实,沉默PU.1能够降低THP-1巨噬细胞对烟曲霉孢子的杀灭能力。结论在烟曲霉感染过程中,沉默PU.1能够导致炎症因子TNF-α和IL-1p的释放显著减少,而IL-10表达升高。并且,PU.1沉默的THP-1巨噬细胞对烟曲霉孢子的吞噬和杀灭能力明显减弱。