【摘 要】
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自显微成像技术发展至今,人们探索到了别有洞天的微观世界,然而随着科技的进步和社会的发展,人们在寻找一种定量、非接触式的方法来获取样本的三维信息。通过对当代显微成像技术的对比发现,基于生物荧光的方法虽然可实现定量测量,但是会损伤/杀死样本细胞,无法实现非接触式测量;而数字全息技术虽然可实现当下需求,但是由于需要相干光以及复杂的仪器设备,导致制造成本大幅提高。因此最终选用基于光强传输方程的方法来恢复相
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自显微成像技术发展至今,人们探索到了别有洞天的微观世界,然而随着科技的进步和社会的发展,人们在寻找一种定量、非接触式的方法来获取样本的三维信息。通过对当代显微成像技术的对比发现,基于生物荧光的方法虽然可实现定量测量,但是会损伤/杀死样本细胞,无法实现非接触式测量;而数字全息技术虽然可实现当下需求,但是由于需要相干光以及复杂的仪器设备,导致制造成本大幅提高。因此最终选用基于光强传输方程的方法来恢复相位,以此实现定量、非接触式的样本测量。但目前市面所售卖的相位显微镜较少,在价格高达数万元的同时,设备体积庞大(约50cm*50cm*60cm)、仍需手动对焦,且大部分只应用在细胞成像中。本文针对相位显微成像技术现存的问题,设计一款实时定量相位显微成像系统,命名为Phase Microimaging Box(简称:P.M.Box)。从系统总体设计、光路搭建、器件选型到机械结构的自主设计,保证了研发成本(最终制作成本在5000元以内)的同时,大幅降低了成像系统的体积,最终整体尺寸控制在了25cm*10cm*20cm以内。为实现较好的人机交互,基于Py Charm平台利用pyqt5技术实现了配套交互软件,以实现更好的系统控制。基于求解光强传输方程进行相位恢复的优势,本文为了进一步加快系统成像的速度,选用双目相机来同时获取相位恢复所需的两张离焦图像。设计了适用于P.M.Box的自动对焦方案,并借助图像清晰度评价函数来快速定位对焦位置。经测试,对焦稳定性误差在0.05mm以内,随后设置相同的离焦距离(本文为0.5mm)来进行相位恢复。在实际过程中发现,由于相机位置摆放及系统误差等外界因素会导致相机采集到的图像出现视场不一致的现象,使得最终相位恢复的准确度大幅下降。因此本文研究并实现了基于特征点的视场校正算法和基于变换域的视场校正算法,但通过实验发现,基于特征点的视场校正方法在针对透明/半透明等特征较少的样本使用时,会出现误匹配现象。因此最终选用精度可达亚像素级的基于变换域的视场校正方法,需注意的是,此算法涉及到迭代,计算量大,但是也仅需在系统安装完后进行一次校正即可。最终使用P.M.Box针对细胞进行相位恢复后求解样本的高度分布,验证了P.M.Box进行相位恢复的可行性。为确保系统性能,对系统的分辨率及相位恢复的准确性进行测试:利用USAF-1951分辨率板在不同物镜倍数下观察可得,系统分辨率在10x下达到了2.19μm,满足系统的需求;利用随机相位板测试得知相位恢复的准确率也达到了标准。为测试P.M.Box的应用场景,利用其观察了A549肺癌细胞在酶化过程中的相位分布状态,及玻璃划痕的定量观测。结果表明,本系统可完美的应用于活细胞的实时观察,并且在透明/半透明平面缺陷的检测中也有重要意义。
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