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目的:动脉粥样硬化和血管退行性病变是导致心血管疾病的主要病因。炎症反应是导致动脉粥样硬化和血管退行性病的病理基础。本研究以SIRT1基因外显子来源的环状非编码RNA circ-Sirt1为研究对象,从整体、细胞和分子水平,探讨circ-Sirt1在血管炎症应答中的作用和分子机制。方法:利用野生型SD大鼠建立颈动脉损伤狭窄模型,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法评价circ-Sirt1与血管炎症损伤的关系。利用Rip和RNA pull-down结合Western blot技术发现并验证与circ-Sirt1相互作用的蛋白。从RNA与蛋白质互作角度探讨circ-Sirt1对NF-κB p65活化及核转位的影响。结果:1 circ-Sirt1参与VSMCs表型调节1.1 RT-PCR筛选人SIRT1基因产生的环状RNA通过对环状RNA数据库circBase搜索,发现人SIRT1基因能产生11种环状RNA产物,RT-PCR检测11种环状RNA在人VSMCs中的表达情况。结果显示,hascirc0093887（circ-Sirt1）表达量较高,在人类基因组中定位于:chr10:69647174-69669199。环状RNA circ-Sirt1由SIRT1基因外显子2-7共价闭合环化而成。为确定circ-Sirt1在大鼠平滑肌细胞中的表达,设计引物从大鼠VSMCs中PCR扩增circ-Sirt1全长序列,对PCR产物测序证实circ-Sirt1在大鼠VSMCs中的表达。Blast序列比对发现,大鼠circ-Sirt1全长序列与人circ-Sirt1序列同源性高达93%,circ-Sirt1进化上高度保守。1.2 circ-Sirt1广泛表达于体内各组织和细胞采用荧光定量PCR检测circ-Sirt1在大鼠心脏、肝脏、脾脏、脑、动脉、静脉等组织中的表达,结果表明,circ-Sirt1在体内各组织中都有分布,其中在动脉组织中表达量最高。此外,荧光定量PCR结果表明circ-Sirt1在血管细胞中均有不同程度表达,其中在VSMCs中表达较高。结果提示circ-Sirt1可能参与VSMCs稳态维持。为明确circ-Sirt1表达与VSMCs表型转化的关系,分别用PDGF-BB、TNF-α和ATRA处理VSMCs诱导表型转化。结果显示,circ-Sirt1高表达于收缩型VSMCs,在炎症刺激和增殖状态下表达下调。对不同表型VSMCs外泌体circ-Sirt1分析,结果显示,与静息状态下的VSMCs分泌的外泌体相比,增殖型VSMCs分泌的外泌体中circ-Sirt1表达明显降低,提示circ-Sirt1可作为潜在的VSMCs表型转化标志分子。以上结果提示,circ-Sirt1可能参与VSMCs表型转化。2 circ-Sirt1参与调节血管炎症应答2.1血管新生内膜形成过程中circ-Sirt1表达降低为考查circ-Sirt1与血管炎症应答的关系,本实验建立大鼠颈动脉损伤模型,分别在损伤后7 d、14 d、28 d取大鼠血浆和颈动脉组织,检测circ-Sirt1表达变化。结果显示,circ-Sirt1在大鼠颈动脉损伤后7 d、14 d、28 d的血浆和血管组织中表达活性是逐渐降低的。进而,选取临床高血压伴肾切除患者的肾动脉进行组织切片,HE染色显示,高血压患者肾动脉显示明显的内膜增生。组织原位杂交结果证实,circ-Sirt1在新生内膜中表达降低,炎症标志分子VCAM-1、ICAM-1和MCP-1表达上调。为证明circ-Sirt1与动脉粥样硬化的关系,选取动脉粥样硬化患者血浆进行定量PCR分析,结果显示,circ-Sirt1在冠心病患者血浆中表达显著降低,提示circ-Sirt1可作为潜在的动脉粥样硬化临床标志分子。2.2 circ-Sirt1参与VSMCs炎症应答为进一步证实circ-Sirt1对VSMCs炎症应答的调节作用。采用敲低和过表达的方式,检测circ-Sirt1不同表达状态下VSMCs炎症标志分子VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的表达情况。荧光定量PCR和Western blot结果显示,过表达circ-Sirt1可抑制细胞炎症因子VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的表达。相反,敲低circ-Sirt1则增强细胞炎症反应。结果表明,circ-Sirt1是血管炎症应答的负调节因子。2.3 circ-Sirt1抑制NF-κB核转位NF-κB作为体内炎症反应的重要转录调控因子,在炎症激活过程中处于核心位置。体外研究已证实,过表达circ-Sirt1可抑制细胞炎症反应。为探讨circ-Sirt1抑制炎症应答的分子靶点,首先对VSMCs中NF-κB活化进行分析。Western blot结果显示,过表达circ-Sirt1明显抑制TNF-α诱导NF-κB p65核转位激活;反之,敲低circ-Sirt1显著增强TNF-α诱导NF-κB p65核转位激活。结果提示,circ-Sirt1可抑制NF-κB p65的核转位激活。2.4 circ-Sirt1抑制人血管炎症反应为在组织水平进一步证实circ-Sirt1对血管炎症反应的抑制作用,人肾动脉血管环进行体外培养。荧光定量PCR结果显示,过表达circ-Sirt1能明显抑制TNF-α所诱导的血管组织炎症因子VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的表达。3 circ-Sirt1抑制NF-κB激活的分子机制3.1 circ-Sirt1定位于胞浆分别分离提取VSMCs胞浆/胞核组分RNA,荧光定量PCR和细胞原位杂交结果均显示,circ-Sirt1主要定位于胞浆。利用原位杂交与蛋白质免疫荧光染色技术证实,circ-Sirt1与NF-κB p65共定位于胞浆,并且TNF-α诱导的NF-κB p65核转位减少。结果提示,circ-Sirt1与NF-κB p65可能存在相互作用。3.2 circ-Sirt1与NF-κB p65直接相互作用为证明circ-Sirt1与NF-κB p65之间的相互作用,利用Rip实验从蛋白质角度检验circ-Sirt1是否与NF-κB p65结合。结果表明,NF-κB p65与circ-Sirt1存在相互作用。此外,设计生物素标记的circ-Sirt1探针,通过RNA pull-down结合Western blot分析表明,circ-Sirt1与NF-κB p65直接结合。敲低circ-Sirt1表达,从RNA pull-down复合物中检测到的NF-κB p65显著减少。此外,用人VSMCs进行Rip和RNA pull-down分析,进一步验证了二者的相互作用。结果表明,circ-Sirt1通过与NF-κB p65直接结合从而使其滞留于胞浆,抑制TNF-α诱导的NF-κB p65的核转位激活。3.3 circ-Sirt1不影响IκBα的磷酸化降解在NF-κB的经典信号途径中,细胞静息状态下IκBα与NF-κB p65结合,使其以失活状态存在于胞浆中。因此,利用RNA pull-down结合Western blot检测circ-Sirt1是否与IκBα存在相互作用。结果显示,circ-Sirt1并不与IκBα直接相互作用。而且,过表达circ-Sirt1不影响炎症刺激所诱导的IκBα的磷酸化降解。结果表明,circ-Sirt1是一种新的NF-κB RNA抑制物。3.4 circ-Sirt1存在2个NF-κB p65结合区域为探寻circ-Sirt1与NF-κB p65结合的区域,利用catRAPID软件对circ-Sirt1核酸序列及NF-κB氨基酸序列进行预测分析。结果显示,circ-Sirt1核酸序列327-378 nt和726-777 nt两个区域可能是NF-κB p65结合位点。为验证上述预测,分别合成2个结合位点序列的反义DNA序列以封闭circ-Sirt1 327-378 nt和726-777 nt NF-κB p65结合位点。荧光定量PCR结果表明,反义封闭序列的转染并不影响circ-Sirt1的过表达,Rip和RNA pull-down分析显示,circ-Sirt1过表达后与NF-κB p65相互作用增强,反义封闭序列能抑制二者的相互作用。结论:1.circ-Sirt1参与血管炎症应答和VSMCs表型转化,可作为潜在的动脉粥样硬化生物标志。2.circ-Sirt1表达定位于胞浆,通过直接与NF-κB p65相互作用,将其锚定在胞浆中,从而抑制NF-κB核转位激活和VSMCs炎症应答。3.circ-Sirt1是一种新型NF-κB的RNA抑制物。