副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, Vp)是引发食源性疾病的重要病原菌之一调查数据表明,50%～70%因食用海产品引发的腹泻病例是由副溶血弧菌引起的。因此,食品中存在副溶血弧菌对人的健康是一种潜在危险,检查食品中副溶血弧菌数量具有重要的实际意义。由于副溶血弧菌在特殊的生长条件下容易进入不可培养但存活的状态(Viable But Nonculturable, VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。因此,建立一种快速、简洁、准确、敏感的检测食品中副溶血弧菌的分子生物学方法,并对国内食品中副溶血弧菌的污染情况进行调查是一个重要的研究课题。本文探索并建立了定性检测副溶血弧菌的常规PCR方法和利用地高辛标记的寡聚核酸探针方法；同时,为了达到定量检测副溶血弧菌的目的,我们设计并建立了基于TaqMan探针的单一Real-time PCR方法,并在此基础上建立了双重Real-time PCR技术同步定量检测副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的新方法,并对几种方法进行比较研究；最后利用建立的地高辛标记的寡聚核酸探针方法和Real-time PCR方法对华东地区海产品中副溶血弧菌的污染情况进行调查分析。试验Ⅰ常规PCR方法检测副溶血弧菌本试验基于国内外的文献并结合检验检疫局自身检验实际,根据副溶血弧菌的tdh基因设计合成了特异的寡聚核苷酸引物,建立了一种快速检测食品中副溶血弧菌的常规PCR方法,通过对人工布菌样品及检验样品进行试验,结果表明设计的引物具有较强的特异性,扩增产物的DNA片段长度与预期设计相符。本方法可做为一种快速手段,有效地对食品中的上述致病性弧菌进行检测。试验Ⅱ应用地高辛标记的寡聚核酸探针检测副溶血弧菌本研究在PCR技术基础上,扩增tdh基因中长为648bp的特异性片段,应用DIG标记试剂盒对特异扩增产物进行标记,标记探针可与副溶血弧菌DNA的tdh基因特异性地杂交,建立了副溶血弧菌的斑点杂交检测方法。特异性试验结果表明,5株副溶血弧菌均能产生杂交斑点,而其他2株非副溶血弧菌均不能杂交斑点。本试验建立的方法可快速检测海产品中的副溶血弧菌。试验Ⅲ基于TaqMan探针的Real-time PCR方法定量检测副溶血弧菌根据GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针,建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR。通过对9种细菌(12株菌株)的DNA进行扩增,结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,其他8株非副溶血弧菌则不产生,证明了引物和探针具有很高的特异性。细菌纯培养和人工布菌的检测敏感度分别为1CFU/PCR反应体系和10CFU/PCR反应体系,相关系数均为0.99(r2=0.99)。整个试验可于1h内完成。该试验建立的方法可快速定量检测海产品中的副溶血弧菌。试验Ⅳ双重实时定量PCR方法同步检测副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌实验中建立了同步检测副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌双重实时定量PCR方法,通过对10株副溶血弧菌及9株金黄色葡萄球菌和其他种类细菌的检测,证明该方法具有很高的特异性,检测灵敏度均小于10CFU/PCR反应。将10倍梯度稀释至终浓度1.0×103CFU/m1到1.0×107CFU/ml纯培养副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的进行定量扩增。循环阈值(Ct值)和初始细胞数的对数相关性好,相关系数为1.0。干扰实验表明DNA混合液的定量检测结果与副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的纯基因组DNA检测结果一致,对检测的特异性和灵敏性无特别的影响。试验V副溶血弧菌不同检测方法的对比研究为了比较3种检测方法对海产品中副溶血弧菌检测结果的影响,并探讨这些检测手段的利弊。我们以常规培养鉴定方法作为对照,利用建立的常规PCR方法,寡聚核酸探针方法以及Real-time PCR方法对南京地区采集的150份海产品进行副溶血弧菌检测。结果显示,3种方法的阳性检出率一致,但检测所耗费的时间和成本有所差别。通过对3种方法检测结果的统计分析和比较发现,常规PCR方法适于少量样本的定性检测；寡聚核酸探针技术适于大量样品的筛选；而Real-time PCR则适于对样品的定量检测,但成本较高；在对大量样品进行定量监测时,将寡聚核酸探针技术和Real-time PCR方法结合使用,可节约大量的时间和成本。试验Ⅵ2005～2006年华东沿海地区海产品中副溶血弧菌污染状况的调查分析国家食源性疾病监测网发现,我国近年来副溶血性弧菌中毒呈显著上升趋势。为进一步了解华东沿海地区海产品中副溶血性弧菌(Vp)的污染情况,2005年1月～2006年12月对我国华东沿海地区海产品进行监测,共采集882份生的海产品,其中甲壳类340份、虾类284份、鱼类258份,及150份水样。采用实验室建立的寡聚核酸探针技术和Real-time PCR方法进行副溶血性弧菌进行分析。结果显示,33.1%的海产品检测出副溶血弧菌,甲壳类、虾类和鱼类试样中副溶血弧菌阳性率分别为44.1%、20.4%和32.6%；甲壳类、虾类和鱼类阳性试样的Real-time PCR平均定量结果依次为1.0×105/g、7.0×104/g和5.0×104/g。环境水样的副溶血弧菌检出率为11.3%。通过对副溶血弧菌的季节分布情况进行调查和统计分析,发现海产品中副溶血弧菌携带率及其数量以夏秋季节较高,冬春季较少。这些结果证实了副溶血弧菌的消长与季节密切相关,这与副溶血弧菌性食物中毒流行规律也是相一致的。监测结果表明,华沿海地区海产品中副溶血弧菌的污染率较高,必须持续地进行食品中副溶血弧菌的主动监测和污染控制。