【摘 要】
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Src蛋白是一种分子量约60KDa的非受体酪氨酸蛋白激酶.其主要以两种形式存在:病毒癌基因表达蛋白v-Src和细胞癌基因表达蛋白c-Src.c-Src蛋白的表达和活性异常是某些肿瘤发生、
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Src蛋白是一种分子量约60KDa的非受体酪氨酸蛋白激酶.其主要以两种形式存在:病毒癌基因表达蛋白v-Src和细胞癌基因表达蛋白c-Src.c-Src蛋白的表达和活性异常是某些肿瘤发生、发展的原因之一;v-Src蛋白本身就能诱导细胞的转化和肿瘤的发生.它们在胞内信号转导途径中都起着重要的作用.以往的研究大都集中在c-Src蛋白的结构、调控和功能等方面,而对v-src基因的克隆表达及其蛋白产物的相关研究比较少.该文通过构建pGEX-KT/v-src重组质粒,表达纯化出大量有激酶活性的GST-Src蛋白,并对其进行初步的性质分析,着重进行了如下几部分的研究:第一部分:通过研究菌株、细菌诱导前的生长期温度和密度、培养基、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间对大肠杆菌GST-Src蛋白表达的影响,确定v-src基因表达的最佳条件,并对表达产物的纯度和表达量进行初步的分析.第二部分:确立细胞提取物和包涵体制备的最佳条件,即菌体超声破碎120次,每次2s,间隔时间4s;包涵体洗涤温度为4℃,尿素洗涤液的浓度为2M,洗涤时间8h;8M尿素的裂解缓冲液对包涵体进行溶解,蛋白质浓度为0.181 mg/ml.第三部分:确定分离纯化的最佳条件,即4℃过夜洗脱,收集第2-4ml的洗脱组分.第四部分:采用辣根过氧化物酶标记的酪氨酸磷酸化单抗(HRP-PY20)的免疫吸附,检测掺入到poly Glu:Try(4:1)中的磷酸根含量,来分析优化条件下生产的可溶性GST-Src蛋白及其包涵体溶液的酪氨酸激酶比活力.结果表明,洗脱组分中GST-Src蛋白的平均激酶比活力约为0.38 nmol/min/mg,包涵体的激酶比活力约为1.13 nmol/min/mg.
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