背景在2015年,我国共有429.2万新发肿瘤病例和281.4万癌症死亡病例,以肺癌为发病率最高,并且肺癌的死亡率也排在各种不同肿瘤之首。凭借其快速增长的发病率与死亡率,肺癌已经成为对人类健康危害最大的恶性肿瘤。导致肺癌发病率上升的主要原因之一是吸烟,另外环境污染也起到了一定的作用。吸烟的致癌作用主要体现于男性群体,而在女性患者中,基因突变在致癌因素中处于十分关键的地位。根据WHO的病理分类,肺癌按照治疗、预后及生物学特征而划分为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)与小细胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)。其中,NSCLC约占肺癌病理类型的85%左右,而SCLC约占15%。在NSCLC中,肺腺癌约占50%。肺腺癌与小细胞肺癌由于各方面的差异,通常被当作两种疾病来对待。首先,肺腺癌起源于肺泡上皮细胞,而小细胞肺癌起源于神经内分泌细胞;第二,肺腺癌于SCLC在生物学行为上有所不同,SCLC相比腺癌会更早地出现远处器官转移;第三,在治疗及预后方面,相比肺腺癌,SCLC可选择的治疗方式较少,总的5年生存率也仅有6%左右。随着近年对于肺癌发病机制的研究,驱动基因和对应的靶向治疗逐渐浮出水面并应用于临床。驱动基因是指可导致肿瘤发生发展的基因异常,而针对此基因异常的治疗可以有效的延长患者的生存时间。EGFR、ALK等基因的发现,逐渐使晚期肺癌的治疗更加个体化,更加精准。EGFR(epidermal growth factor receptor)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种。该基因突变常见于亚裔的非吸烟女性腺癌患者,出现EGFR敏感突变(18外显子G719X突变/19外显子缺失/21外显子L858R点突变等)的患者在接受酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)如吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)有效率高达70%,使中国EGFR突变型晚期NSCLC患者的中位总生存期达到22个月。EGFR敏感突变患者在接受TKI治疗时,无进展生存期(progression-free survival,PFS)可以达到约12个月。通过耐药病灶的活检,发现耐药的原因约50%是由EGFR20号外显子T790M突变导致,其他基因异常如MET扩增,PIK3CA突变等也占有一定的比例;值得关注的是,5%—15%的耐药是由于出现了病理学转化,即再次活检后出现了小细胞肺癌成分。EGFR突变的肺腺癌在服用TKI并产生耐药之后出现小细胞肺癌的转化,这种现象最初是在2006年由Zakowski发现并作为个案报道,随后世界多地也报道出现同样的转化现象。这种现象中,有3个共同点1.基线时腺癌所携带的EGFR突变状态与耐药后小细胞肺癌所携带的EGFR突变状态完全相同;2.发生小细胞转化现象而导致耐药的患者,其TKI的PFS与其他原因导致的耐药相仿;3.出现转化现象后,对于小细胞化疗方案显示出较好的有效率以及PFS。尽管小细胞转化现象是存在的,然而仅仅转化现象不足以得出耐药这一结论,因为部分携带EGFR敏感突变的小细胞肺癌患者也对TKI有较好的疗效。目前此转化现象的临床特征、对TKI耐药的分子机制以及发生转化的分子机制等尚无研究证实。本研究旨在探索此类转化的临床特征,通过对转化前后的标本进行二代测序(next generation sequencing,NGS)方法来探索转化过程中发生的基因异常,同时在血浆中进行耐药基因检测以探讨对TKI的耐药分子机制,为此类患者的临床治疗策略提供参考。第一部分肺腺癌转化为SCLC的临床特征目的探讨TKI治疗后发生此种转化现象的EGFR突变晚期肺腺癌患者的PFS、总生存期和转化后化疗疗效,并与其它耐药机制患者进行对比。方法筛选出2004年至2014年我中心确诊EGFR敏感突变的肺腺癌并在EGFR-TKI耐药后出现小细胞转化的患者。所有患者的基因检测均取得患者的知情同意。入组标准:1)组织学或细胞学证实为晚期肺腺癌;2)通过DNA测序法或突变扩增阻滞系统法(amplification refractory mutation system.ARMS)检测到EGFR敏感突变(18外显子G719X突变/19外显子缺失/21外显子L858R点突变等):3)接受EGFR-TKI治疗并在耐药后接受第二次活检病理证实为小细胞肺癌;4)有详细的临床治疗与生存随访信息。所有患者信息均来自于广东省人民医院电子病历系统。肿瘤客观疗效评价采用实体瘤评价标准(RECIST1.1),PFS定义为从接受EGFR-TKI治疗开始至疾病进展或任何原因导致的死亡。总生存期(overa ll survival.OS)定义为患者接受EGFR-TKI治疗起至患者死亡的时间。删失数据定义为截止最后随访时间存活或者失访。采用SPSS22.0统计软件对结果进行分析;各组病例临床参数和TKI有效率的检验采用卡方检验分析,单变量生存分析用 Kaplan-Meier法。所有的P值均为双侧检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05有统计学意义。结果1.小细胞转化患者的临床特征6.4%(15/233)患者在接受EGFR-TKI治疗并耐药后出现小细胞转化现象,患者的中位年龄为53岁,多数患者年龄<60岁(86.7%),非吸烟者占76.4%,93.3%(14/15)小细胞转化现象发生于EGFR19号外显子缺失的患者。与非转化患者的年龄、性别、吸烟史和ECOGPS评分等临床因素进行比较,统计学上无显著性差异。2.小细胞转化患者对EGFR-TKI的疗效以及预后。本研究中,共15例患者出现腺癌到小细胞肺癌的转化现象,占全部TKI获得性耐药患者的6.4%(15/233)。这15例患者对TKI的疾病控制率(disease control rate,DCR)为 93.3%,客观缓解率(objective response rate,ORR)为 73.3%。将233名获得性耐药患者根据是否出现小细胞转化分为两组。采用卡方检验比较组患者对EGFR-TKI的ORR和DCR,统计学上无显著差异(P=0.189;P=0.574)。通过生存分析证实此类患者中位PFS为11.7个月(95%CI,8.9-14.4),中位OS为29.4个月(95%CI,23.8-35.0),相比未发生小细胞转化现象的耐药患者的中位 PFS 11.9 个月(95%CI,10.8-13.0)与中位 OS 24.3 个月(95%CI,24.1-27.7),并无显著性差异(P=0.275,P=0.997)。3.小细胞转化患者对小细胞化疗方案的疗效11例患者在转化为小细胞肺癌后分别接受了依托泊苷+顺铂/伊立替康+顺铂方案化疗,ORR为27.3%,DCR为66.7%,中位PFS为3.3个月。结论1.小细胞转化多见于相对年轻、非吸烟的EGFR19号外显子缺失患者,其它临床特征与非转化患者无显著差异。2.小细胞转化患者对EGFR-TKI的疗效以及总生存期与非转化患者相当。3.出现小细胞转化现象后,与EGFR野生型晚期SCLC患者相比,对常见化疗方案敏感性较差。第二部分小细胞转化现象中可能存在的基因异常目的探讨小细胞转化现象中可能存在的基因异常。方法从第一部分中筛选出耐药时出现小细胞转化的15名患者中,选取5名具备基线腺癌与小细胞转化后配对的肿瘤组织标本的患者。对转化前后配对的肿瘤组织标本进行295个基因的NGS,深度为1000X。以探索转化前后可能存在的基因异常。结果1.小细胞转化前后的基因突变状态4例患者具备转化前后配对的DNA标本,并接受了 295个基因的NGS,结果提示4例患者在转化为小细胞之后均携带与基线一致的EGFR与TP53突变。个别患者中存在新增突变以及消失突变。2.TP53突变与RB1突变的丰度均由转化前的20%升高至转化后的80%以上。3.小细胞转化后新出现的基因拷贝数异常4名接受NGS的转化后患者中,其中3名新出现了 DAXX基因的扩增,拷贝数分别为4.7,4.3以及4.2。2名患者出现NOTCH4基因拷贝数的增加,分别为4.6和3.5。2名患者出现了CUL4A基因拷贝数的增加,分别为3.8和6.3。1名患者均出现了EGFR拷贝数的增加,拷贝数变化分别为4.0-43.6。其他拷贝数增加的基因仅见于个别患者。结论1.从腺癌到小细胞转化的过程中,尽管在基线与耐药后均存在TP53与RB1突变。但转化后突变丰度均出现上调,提示TP53与RB1基因出现了杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)现象,即野生型拷贝丢失,可能是导致转化发生的机制之一。2.多个原癌基因基因拷贝数的增加,可能伴随小细胞转化的发生。本研究例数有限,有待于大样本量的深入探索。第三部分小细胞转化现象中导致TKI耐药的分子机制目的探讨在小细胞转化现象中介导EGFR-TKI耐药的分子机制。方法自第一部分中筛选出小细胞转化现象的15名患者。按照研究方法的不同,分为以下3组:1.对于转化后具备肿瘤组织标本的患者,进行DNA提取与EGFR的测序法检测。2.选择配对的基线腺癌与转化后小细胞肺癌的肿瘤组织标本,进行EGFR蛋白水平的检测以探索其表达水平。3.对6名转化前后配对的以及5名转化后患者血浆肿瘤DNA进行168基因的NGS,测序深度为10000X。结果1.在其中一名患者的转化后小细胞肺癌病灶中仍保留与基线相同的EGFR突变,而转移灶的腺癌成分中发现EGFR的T790M耐药突变。其余14名患者在转化后的组织标本中均只发现了与基线相同的EGFR突变。2.全部(2/2)转化患者转化前肿瘤组织中EGFR蛋白呈高表达状态,而对应的小细胞转化后肿瘤组织则呈现为EGFR蛋白低表达状态。3.27.3%(3/11)患者的转化前后配对血浆标本在经过NGS检测后,在转化后血浆中发现EGFR20号外显子T790M突变,而此患者的转化前肿瘤组织中并未发现此突变。结论EGFR表达下调和低丰度T790M突变可能是SCLC转化患者对TKI耐药的分子机制。同时,肿瘤的时间与空间异质性也是导致耐药机制复杂化的重要原因。但仍有待大样本量的深入研究。