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第一部分 DOCK8蛋白缺陷对调节性B细胞功能影响及机制研究 背景： DOCK8免疫缺陷病（Dedicator of cytokinesis 8 deficiency）是一类以反复感染、血清 IgE 水平显著升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性免疫缺陷病;其患者具有明显的过敏症状和自身免疫性疾病表现。DOCK8 蛋白为一种细胞骨架调控分子可激活 Rho-GTP 酶从而参与淋巴细胞发育、迁移及活化等多种细胞功能。调节性 B 细胞（Regulatory B Cell; Breg）是一群可以负性调控T细胞免疫反应的B细胞;主要通过分泌IL-10在多种自身免疫病和过敏及炎症中发挥着缓解疾病的作用。本研究以DOCK8缺陷病患者及DOCK8KO小鼠为模型;拟探究DOCK8缺陷对Breg细胞发育及功能的影响。 方法：利用流式细胞术检测 DOCK8 缺陷病患者外周血及DOCK8KO小鼠脾脏中Breg细胞的比例和数量。通过 DOCK8KO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证DOCK8蛋白缺陷时Breg缺陷是否固有存在。利用DOCK8KO小鼠脾脏CD4+ na?ve T细胞过继移植到CD4KO小鼠实验;明确DOCK8-/-CD4+T细胞是否影响Breg数量。再对DOCK8KO小鼠进行 IL-21替代治疗并观察其对Breg的影响。 结果： 3名DOCK8缺陷病患儿外周血中Breg细胞的数量;与同龄正常对照相比明显下降（对照：2.271±0.1514%;n=10;DOCK8 患者：0.4240±0.2987%;n=3;P=0.0001）。DOCK8KO小鼠脾细胞Breg的数量也较WT小鼠降低;且OVA致敏后其下降更为明显（WT：1.477 ±0.1338%;n=3;KO：0.7133±0.1955%;n=3;P=0.03。WT-OVA：1.913±0.04702%;n=3;KO-OVA：0.09593±0.05788%;n=3;P<0.0001）。DOCK8KO/WT 骨髓嵌合体小鼠模型分析结果显示DOCK8-/-Breg数量下降（比例：WT：1.577±0.1618%;n=3;DOCK8KO：0.4267±0.1120%; n=3;P=0.0043;绝对数：WT：273047 ± 51773;n=3;DOCK8KO：45168±9175;n=3;P= 0.0123）;而DOCK8KO/μMT（B细胞缺陷小鼠） 骨髓嵌合体小鼠模型分析结果显示 DOCK8-/-Breg 数量正常（比例：WT：1.173±0.2849%;n=3;DOCK8KO：1.853±0.3032%;n=3;P=0.1775;绝对数：WT：509810±156319;n=3;DOCK8KO：590132 ±241800;n=3;P=0.7941）。将DOCK8KO小鼠或WT小鼠的CD4+na?ve T细胞过继移植到CD4+T细胞缺失（CD4KO）的小鼠中;经OVA或KLH免疫后检测;结果发现接受DOCK8-/-CD4+na?ve T细胞的CD4KO小鼠脾脏细胞Breg数量明显降低（WT-OVA：1.572±0.2849%;n=4;DOCK8KO-OVA：0.654±0.3523%; n=4;P=0.037; WT-KLH：1.260±0.3728%;n=4;DOCK8KO-KLH：0.2005±0.06033%;n=4;P=0.0309）。另一方面;通过给DOCK8KO小鼠补充外源性IL-21; 其脾脏细胞Breg数量可恢复至正常。对于LPS诱导CD5+CD1dhi B细胞中的STAT3磷酸化水平;DOCK8KO小鼠较WT下降;而对于IL-21诱导CD5+CD1dhi B细胞中的STAT3磷酸化水平;DOCK8KO小鼠较WT无明显差异。 结论：DOCK8 蛋白缺陷时 Breg 细胞数量及功能存在固有缺陷;且该缺陷是由于DOCK8蛋白缺失引起CD4+T分泌IL-21功能降低所导致;而外源性补充IL-21可恢复Breg数量至正常。推测其机制是由于DOCK8KO小鼠中LPS诱导STAT3磷酸化缺陷导致LPS诱导Breg分泌IL-10障碍;而IL-21可以通过诱导STAT3磷酸化从而恢复Breg分泌IL-10功能。 第二部分 DNA连接酶IV综合征患儿临床、免疫学特征及基因突变分析 背景：DNA 连接酶 IV 缺陷病是一种罕见的常染色体隐性遗传的原发性免疫缺陷病;由LIG4基因突变导致。临床表现为辐射敏感;生长发育迟缓;小头畸形;联合免疫缺陷;自身免疫性疾病和肿瘤等。国内外现有不到30例病例报道;尚无回复突变及其临床转归报道。该病的临床特点、分子和免疫学特征仍未完全阐明。 方法：本研究纳入 7 名经 Sanger 测序或二代测序确诊具有 LIG4基因突变的病人;并对其临床资料进行分析。对一例疑诊具有回复突变患儿;我们采集或分选了其口腔黏膜细胞、T淋巴细胞、NK细胞和粒细胞;扩增其LIG4基因并进行TA克隆实验。同时;我们也分析了患者的TCR-Vβ多样性和T淋巴细胞增殖功能。 结果：7名中国患者均有联合免疫缺陷（反复慢性腹泻为其主要特点）;小头畸型和生长迟缓表现;其中一例（P1）发生了非霍奇金淋巴瘤。所有患者具有c.833 G>T（p.R278L）突变;可能为中国人群的一个突变热点。患者TCR-Vβ多样性受限;T淋巴细胞增殖实验提示其T细胞对PHA的增殖功能受损。通过对P6的口腔黏膜细胞、T淋巴细胞、NK细胞和粒细胞的LIG4基因TA克隆分析;结果显示这些细胞均有一个正常的 LIG4 等位基因和另一个含父源和母源两个突变位点的等位基因;提示P6存在回复突变现象。然而;该患者疾病表现并没有明显缓解。 结论：本研究描述了中国7名LIG4缺陷病患者临床和免疫学特征;并发现了该基因在中国人群中的 5 个新发突变和和一个潜在的热点突变。这种疾病的临床及免疫学表现具有一定变异度。自发性的体细胞回复突变并不足以改善该病的严重程度和长期生存时间。对于具有联合免疫缺陷表现合并小头畸形、辐照敏感的儿童;应考虑 NHEJ 通路缺陷病可能;并行相应免疫功能筛查及基因突变分析以确诊。