第一部分引言脓毒症是一种危及生命的疾病,是由于宿主对感染的反应失调而导致的。脓毒症心肌损伤（Sepsis-induced myocardial dysfunction,SIMD）是脓毒症的常见并发症,其特征是心肌收缩力下降、心室舒张受损和心输出量减少。这些变化会导致低血压、组织灌注减少,并最终导致器官衰竭。SIMD在早期是可逆的,因此及时识别和管理脓毒症造成的心肌损伤对于改善患者预后和降低死亡风险非常重要。目前有几种生物标志物与脓毒症中的心肌损伤相关,包括:肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase Myocardial Band,CK-MB）、肌钙蛋白、B型钠尿肽、和C反应蛋白等,但是缺乏特异性。故寻找新的生物标志物对早期及时准确诊断SIMD具有重要意义。SIMD是由多种机制的复杂相互作用引起的,其中包括炎症、氧化应激和心肌细胞凋亡。这些机制形成了一个恶性循环,最终导致心肌损伤。因此,可以从减轻炎症、氧化应激和心肌细胞凋亡等方面入手治疗SIMD。高通量测序（High-throughput sequencing,HTS）技术通过实现对大量DNA或RNA的快速且经济高效的测序,彻底改变了基因组学领域。近年来,HTS越来越多地应用于各种疾病的研究。生物信息学分析在HTS数据分析中起着至关重要的作用,因为这些技术产生的大量序列信息需要复杂的计算方法来解释。HTS和生物信息学分析的整合可以使我们深入了解脓毒症引起的心肌损伤所涉及的潜在分子机制,提高我们对SIMD基因层面的理解,并有助于确定潜在的治疗靶点。青藤碱是从中药青风藤中提取出来的天然生物碱,目前研究发现其在多种炎症疾病中具有抗炎作用。青藤碱可以调节与炎症和氧化应激有关的各种信号通路。此前已有研究表明,青藤碱可通过防止氧化应激、炎症和心肌细胞凋亡来减轻心肌缺血再灌注损伤,并减少心肌缺血再灌注损伤引起的心律失常。但是青藤碱是否对SIMD存在保护作用尚未可知。研究表明,青藤碱具有抗炎、免疫调节和抗氧化特性,可能有助于缓解与SIMD相关的病理生理变化。青藤碱具有作为SIMD治疗剂的潜力,但需要进一步研究以充分阐明其作用机制。细胞因子信号转导抑制因子3（Suppressor of Cytokine Signaling 3,SOCS3）在炎症和免疫反应的调节中起着重要的作用。SOCS3通过抑制信号转导和STAT信号通路的激活来调节炎症反应,还可通过调节促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达来调节细胞凋亡。SOCS3已被证明可以调节脓毒症期间促炎细胞因子的水平。有研究报道,IL-33通过激活SOCS3抑制IL-17通路,在脓毒症进展中发挥负向调节作用,减轻脓毒症带来的器官损伤。另一方面,抑制SOCS3可以增加促炎细胞因子的水平并恶化脓毒症的结果。这些发现表明,靶向SOCS3可能代表一种预防和治疗脓毒症引起的心肌损伤的新型治疗策略。因此需要进一步的研究来充分阐明SOCS3在SIMD中的潜在作用机制,并探索其作为脓毒症相关心血管并发症治疗靶点的潜力。第二部分生物信息学分析鉴定脓毒症心肌损伤的关键差异表达基因目的:1.使用HTS数据进行生物信息学分析,在基因水平层面上筛选并鉴定SIMD的关键差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）。2.建立心肌细胞SIMD模型（包括小鼠心肌细胞HL-1和人心肌细胞AC16）,在细胞模型中验证SIMD关键DEGs的表达。方法:1.通过对从GEO数据库下载的关于SIMD的微阵列数据集GSE53007（由小鼠心脏组织样本组成）和GSE79962（由人心脏组织样本组成）进行综合生物信息学分析,鉴定SIMD中的DEGs。2.利用生物信息学分析对DEGs进行深入探索,包括GO和KEGG通路富集分析、PPI网络构建、关键DEGs的鉴定等。3.确定前十名的关键DEGs后,再通过用LPS（1ug/ml）处理HL-1细胞和AC16细胞构建心肌细胞SIMD模型,并进行q PCR实验检查这前十名的DEGs在心肌细胞SIMD模型中的表达。结果:1.通过生物信息学分析后,从GSE53007中共鉴定出423个DEGs,其中上调基因294个,下调基因129个。从GSE79962中共鉴定出121个上调基因和70个下调基因。在两个数据集中,有22个上调基因和1个下调基因重叠。2.经过对DEGs进行深入探索,确定了SOCS3、STAT3、CCL2、IL1R2、TIMP1、JUNB、S100A9、OSMR、ZFP36和HAMP这前十位的关键DEGs。3.经过qPCR实验验证表达后发现,SOCS3、STAT3、CCL2、IL1R2、JUNB、S100A9、OSMR、ZFP36和HAMP这9个关键DEGs在建立的心肌细胞SIMD模型（HL-1和AC16）中的表达显着升高（P＜0.05）。小结:经生物信息学分析和qPCR实验验证,证实SIMD的关键差异表达基因SOCS3、STAT3、CCL2、IL1R2、JUNB、S100A9、OSMR、ZFP36、HAMP在建立的心肌细胞SIMD模型中的表达显着升高,这些基因可能在SIMD中发挥重要作用。第三部分青藤碱对脓毒症心肌损伤的保护作用目的:1.探究青藤碱对SIMD小鼠是否具有保护作用。2.观察关键差异表达基因SOCS3在SIMD小鼠中使用青藤碱后的变化。方法:1.使用C57BL/6J雄性小鼠经盲肠结扎和穿刺处理建立小鼠SIMD模型。将小鼠随机分为3组,假手术组（Sham组,8只）:仅行开腹关腹,不进行其他操作,于术后6h注射生理盐水;盲肠结扎和穿刺组（CLP组,8只）:经盲肠结扎穿孔法构建小鼠SIMD模型,并于术后6h注射生理盐水;青藤碱治疗组（SIN组,8只）:经盲肠结扎穿孔法构建小鼠SIMD模型,并于术后6h注射青藤碱。在术后24h对小鼠进行安乐死。2.在术前,术后6h及术后24h行小鼠心脏彩超,测定左室舒张内径、左室收缩内径、左室射血分数和左室缩短分数以评估小鼠心功能。3.通过酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）法测量小鼠血清中炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和CK-MB的水平,测定心肌中SOD和MDA水平。4.使用HE染色检测心肌组织病理变化。5.使用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。6.通过qPCR和免疫组化检测SOCS3基因和蛋白的表达。7.通过WB检测炎症通路相关蛋白TLR4和p-NF-κB P65、关键差异表达基因SOCS3蛋白、凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:1.心脏彩超结果表明,在术后6h时,CLP组和SIN组小鼠的心功能较Sham组明显下降。说明在进行CLP后6h,小鼠发生脓毒症心肌损伤。而在使用青藤碱治疗后,SIN组小鼠的心功能得到部分恢复。2.与Sham组相比,CLP组和SIN组的炎症因子有所升高。而与CLP组相比,SIN组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和CK-MB的水平显著降低（P＜0.05）,表明青藤碱具有抗炎作用。3.与CLP组相比,SIN组小鼠心肌中的SOD水平升高和MDA水平降低（P＜0.05）,表明青藤碱具有抗氧化应激作用。4.HE染色结果显示,与Sham组相比,CLP组心肌纤维断裂、心肌横纹模糊,间质水肿,炎症浸润。青藤碱给药处理后,心肌细胞排列较紊乱,结构较清晰,有轻微出血,SIN组心肌纤维虽仍有少量断裂,但心肌组织细胞损伤明显得到了改善。5.TUNEL结果显示CLP组有明显绿色荧光,细胞凋亡增加。青藤碱给药处理后,相比于CLP组,SIN组的绿色荧光明显减少,细胞凋亡降低。表明青藤碱可以减轻SIMD中的心肌细胞凋亡,具有抗凋亡作用。6.qPCR和免疫组化的结果提示在小鼠SIMD模型中使用青藤碱后,会引起关键差异表达基因SOCS3的上调（P＜0.05）。7.WB结果显示,与Sham组相比,CLP组的TLR4、p-NF-κB P65、SOCS3、Bax和Caspase3蛋白表达显著升高（P＜0.05）,Bcl-2蛋白表达显著下降（P＜0.05）;与CLP组相比,SIN组SOCS3和Bcl-2蛋白表达均显著升高（P＜0.05）,TLR4、p-NF-κB P65、Bax和Caspase3蛋白表达显著下降（P＜0.05）。小结:1.青藤碱可以使SIMD小鼠中关键差异表达基因SOCS3的表达上调。2.青藤碱可改善SIMD小鼠的心脏功能,减少炎症因子的释放,降低心脏组织内氧化应激水平和减轻心肌细胞凋亡。青藤碱对SIMD具有保护作用。第四部分青藤碱通过调节SOCS3对脓毒症心肌损伤的保护作用目的:1.构建Si RNA介导的SOCS3基因沉默HL-1小鼠心肌细胞。2.通过HL-1小鼠心肌细胞SIMD模型验证青藤碱是否通过调节SOCS3对脓毒症心肌损伤产生保护作用。方法:1.培养HL-1小鼠心肌细胞,当细胞密度达70%时,准备转染;48h后通过WB检测SOCS3的表达水平。构建好沉默SOCS3用于后续的挽救实验。2.将HL-1小鼠心肌细胞分为6组进行后续实验。（1）空白对照组（Control组）:正常培养HL-1小鼠心肌细胞,无特殊处理。（2）脓毒症心肌损伤组（LPS组）:加入LPS（1ug/ml）共孵育24h。（3）青藤碱对照组（SIN组）:加入青藤碱（0.2 m M）共孵育24h。（4）青藤碱治疗脓毒症心肌损伤组（LPS+SIN组）:加入青藤碱（0.2 m M）和LPS（1ug/ml）共孵育24h。（5）青藤碱治疗脓毒症心肌损伤加干扰空载组（LPS+SIN+NC组）:在si RNA-NC转染48小时后的细胞中加入青藤碱（0.2 m M）和LPS（1ug/ml）共孵育24h。（6）青藤碱治疗脓毒症心肌损伤加SOCS3干扰组（LPS+SIN+Si组）:在si RNA-SOCS3转染后48小时的细胞中加入青藤碱（0.2 m M）和LPS（1ug/ml）共孵育24h。3.通过ELISA法测量HL-1小鼠心肌细胞上清中的炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和CK-MB的水平。4.通过ELISA法测量HL-1小鼠心肌细胞内SOD和MDA水平。5.流式细胞学检测心肌细胞凋亡率。6.qPCR检测关键差异表达基因SOCS3基因的表达。7.通过WB检测炎症通路相关蛋白TLR4和p-NF-κB P65、关键差异表达基因SOCS3蛋白、凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:1.使用Si-1062组的SOCS3表达显著下降,干扰有效（P＜0.05）。2.炎症相关指标。（1）ELISA结果显示:与Control组相比,SIN组细胞上清中炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和CK-MB的水平无变化（P＞0.05）。LPS组相比与Control组,这些指标的水平都上升（P＜0.05）。与LPS组相比,在LPS+SIN组中这些指标的水平下降（P＜0.05）。挽救实验结果表明,沉默SOCS3后,相比于LPS+SIN组,LPS+SIN+Si组这些指标的水平又升高了（P＜0.05）,并与LPS组无差别（P＞0.05）。（2）WB结果显示:与Control组相比,SIN组的TLR4和p-NF-κB P65的表达无差异（P＞0.05）。相比于Control组,LPS组中TLR4和p-NF-κB P65的表达升高（P＜0.05）。相比于LPS组,LPS+SIN组TLR4和p-NF-κB P65的表达下降（P＜0.05）。沉默SOCS3后,相比于LPS+SIN组,LPS+SIN+Si组TLR4和p-NF-κB P65的表达升高（P＜0.05）,且与LPS组无差别（P＞0.05）。结果表示在生理情况下,青藤碱不会引起正常HL-1心肌细胞炎症相关指标的变化。在SIMD中,青藤碱可以发挥抗炎作用保护心肌细胞。而沉默SOCS3可以逆转青藤碱在SIMD中的抗炎作用,说明青藤碱在SIMD中依赖调节SOCS3发挥抗炎作用。3.氧化应激相关指标:ELISA结果显示,与Control组相比,SIN组的SOD和MDA含量无变化（P＞0.05）。相比与Control组,LPS组心肌细胞中的SOD含量下降,MDA含量升高（P＜0.05）。与LPS组相比,LPS+SIN组心肌细胞中的SOD含量升高,MDA含量下降（P＜0.05）。LPS+SIN+Si组相比于LPS+SIN组,心肌细胞中的SOD含量下降,MDA含量升高（P＜0.05）,且与LPS组无差别（P＞0.05）。结果表示在生理情况下,青藤碱不会引起正常HL-1心肌细胞氧化应激相关指标的变化。在SIMD中,青藤碱可以发挥抗氧化应激作用保护心肌细胞。沉默SOCS3可以逆转青藤碱在SIMD中的抗氧化应激作用,说明青藤碱在SIMD中通过调节SOCS3发挥抗氧化应激作用。4.凋亡相关指标。（1）流式细胞学检测后发现,Control组和SIN组的凋亡率无差别（P＞0.05）。LPS组相比于Control组,凋亡率明显升高（P＜0.05）。LPS+SIN组相比于LPS组,凋亡率显著下降（P＜0.05）。LPS+SIN+Si组相比于LPS+SIN组,凋亡率显著升高（P＜0.05）,且与LPS组无差别（P＞0.05）。（2）WB结果表示,与Control组相比,SIN组的Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达无差异（P＞0.05）。与Control组相比,LPS组Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达显著下降（P＜0.05）。LPS+SIN组相比于LPS组,Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高（P＜0.05）。相比于LPS+SIN组,LPS+SIN+Si组的Caspase-3和Bax的蛋白表达水平显著升高,Bcl-2的蛋白表达显著下降（P＜0.05）,且这3个蛋白的表达水平变化与LPS组无差别（P＞0.05）。结果表示在生理情况下,青藤碱不会引起正常HL-1心肌细胞凋亡相关指标的变化。在SIMD中,青藤碱可以发挥抗心肌细胞凋亡的作用。沉默SOCS3可以逆转青藤碱在SIMD中的抗心肌细胞凋亡作用,说明青藤碱在SIMD中的抗心肌细胞凋亡的作用依赖SOCS3。5.关键差异表达基因SOCS3表达测定结果:q PCR和WB结果均表明,相比于Control组,LPS组的SOCS3的m RNA和蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。SIN组的SOCS3的m RNA和蛋白表达水平与Control组无差异（P＞0.05）,说明在正常心肌细胞中使用青藤碱,不会引起SOCS3的变化。LPS+SIN组相比于LPS组,SOCS3的m RNA和蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。结果说明在生理情况下,青藤碱不会刺激正常HL-1心肌细胞SOCS3的表达升高。在SIMD中青藤碱能上调SOCS3的表达。小结:1.在生理状态下使用青藤碱不会对HL-1心肌细胞造成炎症、氧化应激和细胞凋亡等方面影响,也不会刺激SOCS3表达上调。2.在沉默SOCS3后,青藤碱对SIMD的保护作用消失。青藤碱是通过上调SOCS3的表达来减轻脓毒症诱导的心肌损伤中的炎症、氧化应激和细胞凋亡。第五部分研究结论1.经生物信息学分析和q PCR实验验证,确定SIMD的关键差异表达基因SOCS3、STAT3、CCL2、IL1R2、JUNB、S100A9、OSMR、ZFP36、HAMP在SIMD模型中的表达显著升高。2.青藤碱可以使SIMD小鼠中关键差异表达基因SOCS3的表达上调。3.青藤碱可改善SIMD小鼠的心脏功能,减少炎症因子的释放,降低心脏组织内氧化应激水平和减轻心肌细胞凋亡。青藤碱对SIMD具有保护作用。4.在生理状态下使用青藤碱不会对HL-1心肌细胞造成炎症、氧化应激和细胞凋亡等方面影响,也不会刺激SOCS3表达上调。5.在沉默SOCS3后,青藤碱对SIMD的保护作用消失。青藤碱是通过上调SOCS3的表达来减轻脓毒症诱导的心肌损伤中的炎症、氧化应激和细胞凋亡,从而对SIMD产生保护作用。