背景循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是从实体瘤浸润转移或脱落而存在于外周血循环中的一类肿瘤细胞,它与肿瘤的复发转移密切相关。临床研究表明,外周血中循环肿瘤细胞的数量与肿瘤患者的临床分期、疾病状态等密切相关。但是由于CTCs数量极少,对其进行研究必须先进行富集。膜滤过分离技术(Isolating by size of epithelial tumor cells,ISET)技术利用肿瘤细胞体积通常大于正常血细胞,并且变形性也比正常血细胞差的原理,将大体积细胞筛选截留在滤膜表面,再通过细胞形态学、免疫细胞化学的方法进行定性。目的本课题组前期对ISET技术进行改良研究,开发出了自动化检测设备CTC-Biopsy。本实验的目的是完善和优化CTC-Biopsy检测系统,并通过临床试验验证其检测肿瘤患者外周血中CTC的效果,探讨其临床推广应用的价值。方法1.使用A549、FADU、MB-MDK-468、PC3、PAN-2、MGC803、SMMC7721等肿瘤细胞系分别采用Millipore滤膜和CTC-Biopsy滤膜从以下4个方面对CTC-Biopsy检测系统进行优化:1)应用多种肿瘤细胞系细胞经CTC-Biopsy检测系统检测后染色效果的研究;2)应用多种肿瘤细胞系模拟全血环境下经CTC-Biopsy系统检测细胞染色效果的研究;3)应用多种肿瘤细胞系模拟外周血环境下应用CTC-Biopsy检测系统检测肿瘤细胞的截留率;4)应用多种肿瘤细胞系模拟外周血环境下应用CTC-Biopsy检测系统检测肿瘤细胞的截留稳定性和可重复性。2.分别使用单个和成团(SMMC7721)肿瘤细胞系研究CTC-Biopsy检测系统检测过程中高速离心对CTM检出结果的影响。3.通过免疫化学细胞学技术定性验证了CTC-Biopsy检测系统检测肿瘤患者外周血CTC、CTM的准确性。4.按照中国国家食品药品监督局(CFDA,China Food and Drug Administration)的药物临床试验管理规范(GCP,Good Clinical Practice)要求使用CTC-Biopsy检测系统对156例肿瘤患者及22例健康志愿者进行了临床试验。结果1.1)肿瘤细胞系细胞经CTC-Biopsy检测系统染色后,细胞核与胞浆对比明显,细胞核内结构清晰,达到细胞病理学诊断要求;分别使用Millipore滤膜和CTC-Biopsy滤膜对比研究发现:CTC-Biopsy滤膜较Millipore滤膜过滤染色肿瘤细胞系相比背景更清晰,透光度更好。2)CTC-Biopsy检测系统分别使用Millipore和CTC-Biopsy滤膜进行了模拟实验结果显示肿瘤细胞加入全血后经CTC-Biopsy滤膜过滤染色后背景清晰,滤膜表面仅有少量淋巴细胞残留,不影响对结果判别;肿瘤细胞的细胞核、浆对比明显,细胞核结构形态清晰,达到细胞病理学诊断标准,CTC-Biopsy滤膜相较于Millipore滤膜具有更高的透光性,便于镜下观察,滤膜背景更清晰。3)应用免疫细胞化学技术计算得出CTC-Biopsy检测系统使用CTC-Biopsy滤膜检测的等量不同类型肿瘤细胞系细胞截留率均在85%以上,而应用Millipore滤膜时获得的截留率均大于70%。4)CTC-Biopsy检测应用CTC-Biopsy滤膜检测不同数量的肿瘤细胞截留率66.7-90.4%高于使用Millipore滤膜时58.3%-78.5%,CV值2.9-10.8%低于使用Millipore滤膜时4.8-12.4%。2.在模拟的人体血液环境中,单个的肿瘤细胞经过CTC-Biopsy检测系统经过血样预处理处理后,不聚集产生成团肿瘤细胞;结合CTC-Biopsy检测系统检测步骤中高速离心导致CTM打散的模拟实验的结论:成团肿瘤细胞在离心等预处理过程中部分被打散,其原因可能有:(1)培养的成团肿瘤细胞相对粘附比较松散与实际的CTM有一定差距;(2)高速离心可能将细胞团打散;(3)肿瘤细胞并不固定3个或5个细胞为一团,因此在计数可能存在一定的误差。但由此也推断出结论,即:如果应用CTC-Biopsy检测系统在肿瘤患者血液样本中查到成团肿瘤细胞即CTM,可以认为这些细胞之间粘连非常紧密,具有癌栓的特征,或者更具有成为癌栓的潜力。我们推论,在肿瘤患者外周血中检测到的CTM并不因为CTC-Biopsy检测系统产生,而是患者本身在肿瘤的发生发展过程中肿瘤细胞聚集粘附而产生。3.本实验检测结果表明CTC-Biopsy检测系统所截获的细胞中,根据形态学判断标准判定的CTC、CTM,均获得免疫细胞化学技术的验证证实,细胞形态学判断标准可用于CTC、CTM的判断;CTC-Biopsy检测系统染色与免疫荧光染色可检测发生EMT的CTC、CTM。4.GCP临床试验共检测样本为178例,实际有效检测样本为172例,其中健康受试者22例,肿瘤受试者150例,男性133例,女性45例,年龄范围25-81岁,其中肺癌11例,食管癌28例,胃癌44例,结直肠癌46例,肝癌9例,肾癌12例;CTC-Biopsy检测系统检测不分病种恶性肿瘤疾病灵敏度:51.33%,特异性:100%,假阳性率:0.00%,假阴性率:48.67%,阳性预测值:100%,阴性预测值:23.16%,约登指数:0.513。不分病种肿瘤Ⅳ期患者与Ⅰ-Ⅲ期患者检出率无显著性差异;除胃癌外各病种各分期之间检出率无显著性差异;胃癌Ⅳ期患者检出率显著高于Ⅰ-Ⅲ期患者(P=0.002)。本次临床试验肿瘤组病例检出率为51.33%;高于优化检测程序(梯度离心预处理血样)的检出率27.91%。CTC-Biopsy检测系统检测的染色标本背景干净、细胞形态清晰、细胞核质分界清楚;除异常细胞外,样片中仅残留少量的单核细胞。由CTC-Biopsy检测系统的CTC检出率的95%CI下限为43.33%,大于国际ISET法报道的43.06%。结论1.CTC-Biopsy检测系统的细胞染色效果达到细胞病理学诊断要求,截留率达到国际同类检测系统水平,并且稳定性好、可重复性强。2.CTC-Biopsy检测系统检测过程中不产生CTM;肿瘤患者外周血中部分CTC及CTM中部分细胞存在EMT现象。3.通过免疫荧光验证了CTC-Biopsy检测系统检测肿瘤患者外周血中CTC、CTM的性质,证实了形态学判断标准的正确性;4.通过GCP临床试验证实CTC-Biopsy检测系统检测肿瘤患者外周血中CTC灵敏度、特异性等指标均达到国际同类检测系统水平;该系统检测操作简便易行,具有高效、稳定、经济的优点,具有良好的临床推广价值。