丹红注射液生产过程丹参废弃物的资源化利用研究

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丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根,具有祛瘀止痛,活血通经,清心除烦的功效,主要用于治疗月经不调,冠心病,心绞痛,瘀血闭阻所致的胸痹及中风,脑血栓等症。我国药用丹参资源丰富,包括野生丹参和栽培丹参。一般野生丹参有效成分含量高于栽培品,但栽培品生长条件稳定、种植规模大,为目前药材市场主要的商品来源,每年年产量达5000~7000t。  现代研究表明丹参中丹参菲醌类、丹参酚酸类化学成分为其主要的资源性化学成分,具有强心、抗血栓形成、改善微循环、促进组织的修复与再生、抑制过度增生、保肝、抗菌、降血脂等多种生物活性,广泛应用于心脑血管疾病的治疗,并研制出系列产品如复方丹参口服液、复方丹参注射液、复方丹参胶囊、复方丹参滴丸等。  目前在消耗丹参资源的产品生产过程中多采用水提醇沉工艺,产生大量的丹参药渣及醇沉沉淀。研究显示,丹参药渣中尚残存丹参酮类成分,主要为丹参酮ⅡA、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ,与丹参药材基本一致,表明丹参药渣仍可以作为一种提取丹参酮类资源性化学成分的资源,具有良好的开发利用价值。此外,丹参药渣中尚存在大量的植物蛋白、纤维素及糖类等成分。丹参水提醇沉沉淀物中主要含有寡糖类成分,其中以具有重要资源价值的水苏糖含量较高。  本论文选择丹红注射液生产过程丹参固体废弃物为研究对象,开展丹参固体废弃物的资源性化学成分及其资源化利用研究。对丹参酮类、丹酚酸类和纤维素类等资源性化学物质进行资源化学评价,并对其提取分离制备工艺、转化利用技术等进行研究,为丹参固体废弃物的资源综合利用和循环利用提供科学依据和技术支撑,主要研究内容和结论简述如下:  1.丹参药渣中资源性化学成分评价  分别采用紫外可见分光光度法(UV)、高效液相色谱法(HPLC-PAD)、液质联用技术(UPLC-TQ/MS)等方法手段,对丹参药材与药渣中丹参酮类、丹酚酸类、多糖类、蛋白类、纤维素、木质素、核苷类及氨基酸类成分进行分析与评价,以明确其资源利用价值与可利用性,结果如下:  (1)丹参酮类成分研究表明,丹红注射液生产过程产生的丹参固体废弃物中丹参酮类成分与丹参药材相比,几乎未被利用而残留于固体药渣中,主要包括二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA,在固体废弃物中最优含量为0.9635 mg/g、2.7085 mg/g、1.4953 mg/g和2.8258 mg/g,分别是原药材中含量的100.53%、100.22%、75.91%、87.21%。  (2)丹酚酸类成分分析表明,丹参药渣中尚含有一定量的丹酚酸类成分,水提后丹参药渣中丹酚酸A、原儿茶醛的含量高于丹参药材。丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的含量为0.1520 mg/g、0.0062 mg/g、0.8291 mg/g和4.7471 mg/g是原药材中含量的19.43%、16.71%、26.04%和11.14%,原儿茶醛和丹酚酸A含量为0.4471 mg/g和1.7273 mg/g是原药材中的1212.8倍和4.3倍。  (3)多糖类成分分析表明,丹参药材中多糖的含量为11.20%,丹参药渣中多糖含量为4.17%,丹红注射液生产中丹参醇沉沉淀物中的多糖含量为43.78%,是原药材374.29%。  (4)蛋白质类成分分析表明,丹参药材中蛋白的含量为25.97 mg/g,丹参药渣中含量为7.69mg/g,醇沉沉淀物中蛋白的含量为88.74 mg/g。  (5)纤维素类成分分析表明,药材与药渣中木质素类物质含量分别为19.38%、22.52%,药材与药渣中纤维素的含量分别为22.94%、27.57%。  (6)核苷类成分分析结果表明,丹参药渣中鸟嘌呤含量可达852μg/g,腺嘌呤为20.35μg/g,尿苷20.77μg/g,黄嘌呤14.52μg/g。药材中鸟嘌呤其含量可达3551μg/g,其次2-脱氧胞苷330.4μg/g,尿苷含量为96.81μg/g,腺嘌呤50.32μg/g,黄嘌呤54.54μg/g。  (7)氨基酸类成分分析结果表明,药丹参渣中苯丙氨酸平均含量最优7769μg/g,其次为甘氨酸1295μg/g、L-脯氨酸594.2μg/g、酪氨酸224.5μg/g、鸟氨酸143.6μg/g、L-天冬氨酸94.35μg/g,药材中苯丙氨酸平均含量最优5875μg/g,其次为L-脯氨酸2897μg/g、L-赖氨酸2786μg/g、谷氨酰胺2736μg/g、甘氨酸1680μg/g、谷氨酸768.1μg/g、L-天冬氨酸346.1μg/g、天冬酰胺142.5μg/g、鸟氨酸91.47μg/g。  综上,丹参药渣中富含丹参酮类资源性物质,其在丹红注射液生产制备过程中未得到利用;丹参药渣中尚含有一定量的丹参酚酸类成分,值得进一步转化利用。此外,丹参药渣中尚含有丰富的氨基酸类、核苷类、纤维素类、木质素类等资源性化学物质。丹参醇沉沉淀物中含有丰富的多糖类与蛋白类物质;提示应对其进行综合利用,以提升丹参资源利用效率和利用价值。  2.丹参药渣中资源性化学成分的提取制备研究  (1)丹参酮类成分的提取制备工艺以二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA和总丹参酮为评价指标,通过正交试验优化,乙醇用量和乙醇浓度是影响丹参酮类成分提取效果的主要影响因素,最终确定最佳提取工艺为10倍量90%乙醇,提取2次,每次2h。  (2)丹参酚酸类成分的提取制备工艺以丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和总酚酸为评价指标,最终确定丹参酚酸类成分的最佳提取工艺为12倍量的80%乙醇,提取2次,每次2h。  (3)溶剂萃取法纯化富集丹参酮类成分通过乙酸乙酯+8%的碳酸钠可以除去丹参药渣粗提物中大多数的丹酚酸,纯化制备丹参酮类化学成分,得到二氢丹参酮Ⅰ,隐丹参酮,丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA的含量为1.083%、3.871%、5.431%和6.481%,是原来粗提物含量的7.5倍、9.6倍、9.2倍、11.8倍。  (4)大孔吸附树脂法纯化制备丹参酮类和丹参酚酸类成分纯化后二氢丹参酮Ⅰ的含量达到14.93%,隐丹参酮的含量达24.53%,丹参酮Ⅰ的含量达28.00%,丹参酮ⅡA的含量达32.41%,丹酚酸B最优可达90.79%,迷迭香酸可达24.35%,丹酚酸A为22.53%,原儿茶醛为15.15%,丹参素6.454%。  (5)硅胶柱层析法纯化制备丹参酮类成分通过硅胶柱层析后,丹参药渣中丹参酮类资源性化学成分丹参酮ⅡA的含量高达96%以上,得到的丹参酮ⅡA总量约26mg,得率为76%。  3.丹参药渣中资源性化学成分的转化利用研究  (1)通过光合细菌对丹参中资源性化学成分的转化利用研究,发现丹参药材水提液和醇提液浓度分别为49 g/L和12 g/L时,培养3-4天的沼泽红假球形单胞菌活性达到最优;丹参药材水提液浓度在5 g/L-19g/L范围内,光合菌对丹酚酸类成分的转化作用明显;丹参药材醇提液浓度在6g/L-48g/L范围内,光合菌对丹酚酸类成分的转化作用表现为丹酚酸B提高近4倍,丹酚酸A提高了3倍,迷迭香酸提高了近2倍。  (2)通过光合细菌对丹参药渣中资源性化学成分的转化作用,发现当丹参药渣醇提液浓度为49g/L时,培养3-4天的沼泽红假球形单胞菌活性最优;丹参药渣水提液浓度为122g/L时,培养3-4天沼泽红假球形单胞菌活性最优。丹参药渣水提液中酚酸类成分发生了不同程度的提高,总酚酸的含量提高了近3倍,原儿茶醛的含量提高了2倍多,咖啡酸、原儿茶酸提高了1倍多,丹参素提高了4倍,丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸都提高了3倍,其中丹酚酸B,有部分浓度提高了11倍。同时,丹参药渣水提液中氨基酸类成分大幅下降,根据文献研究报道,可提示光合细菌转化形成丹酚酸类成分的机理可能是由苯丙氨酸、酪氨酸在系列酶的作用下,逐步合成为丹酚酸类成分。  (3)通过利用糖化技术对丹参药渣的转化利用发现在固体酶液和不同预处理的丹参药渣中,葡萄糖的含量在碱处理药渣的效果最好,含量为119.50mg/g;当底物酶浓度为6U/ml葡萄糖的含量随之增长平稳,浓度为59.74mg/g;在酶浓度为6U/ml的时候,在4.5天到5.5天后葡萄糖的浓度为74.60mg/g-79.60mg/g,且基本不再大幅度的增加。丹参酮类成分提取量在通过酶液降解后,丹参酮ⅡA提取量提高94.8%,丹参酮Ⅰ提取量提高81.6%,隐丹参酮提取量提高69.2%,二氢丹参酮提取量提高35.0%。  通过以上对丹红注射液生产过程产生的固体废弃物的研究,示范性的研究固体废弃物的利用价值模式,研究其中的有效物质,采用不同纯化方法、借鉴前人的研究与生物转化新技术等方法提升其资源利用效率、延伸资源经济产业链,从而促进中药资源产业的发展,为系统的分析评价及有效开发固体废弃物提供科学依据。
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