血吸虫病是由血吸虫感染引起的危害严重的人畜共患寄生虫病,在我国流行的是日本血吸虫病,目前仍是我国最重要的公共卫生问题之一。日本血吸虫可感染40多种哺乳动物宿主,不同宿主对血吸虫感染的适宜性存在较大的差别。山羊、黄牛、绵羊、兔子和小鼠等都是其适宜宿主,血吸虫的发育率可达50%-70%,而在大鼠、水牛等非适宜宿主体内血吸虫的发育率仅为10%左右,东方田鼠是至今发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物,血吸虫感染东方田鼠后,虫体发育迟缓,大部分虫体在感染后15天死亡,不能发育成熟。不同的宿主有着独特的机体内环境,会影响日本血吸虫的生长发育、雌雄合抱和虫卵形成,最终影响虫体在宿主体内的存活状态及宿主的病理变化。miRNA是一种内源性的非编码小RNA分子,研究发现其在多个生物学过程如生长发育、凋亡、增殖、细胞分化、能量代谢、免疫调控及肿瘤发生等发挥重要的作用。本研究利用Solexa高通量测序技术,对不同适宜性啮齿类宿主来源的童虫进行miRNA的鉴定及分析,对与miRNA调节息息相关的血吸虫凋亡通路及凋亡相关基因作了分析；利用miRNA芯片比较、分析小鼠、大鼠和东方田鼠三种不同适宜性宿主感染日本血吸虫前后miRNA的表达谱变化。本研究可加深理解miRNA在血吸虫的生长发育、与宿主相互作用等生物学过程中发挥的调节作用提供理论基础,也可为筛选血吸虫的早期诊断分子标记、疫苗候选分子和新治疗药物靶标提供新的思路和新途径。一、不同适宜性啮齿类宿主来源日本血吸虫童虫miRNA的初步鉴定及血吸虫凋亡研究用Solexa深度测序法对小鼠、大鼠和东方田鼠来源的日本血吸虫童虫进行测序,结果一共得到35585878条高质量的reads,其中有效的reads共有28088302条。进一步的生物信息学分析表明,小鼠来源的童虫中有131个miRNA,大鼠来源的童虫中有100个,东方田鼠来源童虫有144个,其中有32个miRNA在三种宿主来源童虫中均有表达,并对已知的28个日本血吸虫miRNA分子进行聚类和差异表达分析。本研究共鉴定出50个新miRNA分子,其中保守的有34条,日本血吸虫特有的有16条。这些miRNA分子的发现对研究日本血吸虫在不同宿主体内的生长发育、凋亡、营养代谢及相互作用提供了有价值信息,为后续深入研究miRNA分子在血吸虫基因表达调控中的可能作用机制提供了理论依据。本课题组前期研究表明凋亡是促使日本血吸虫在东方田鼠体内消亡的主要原因之一,研究中对不同宿主来源童虫的miRNA进行分析时也发现部分差异表达的miRNA可能与凋亡调控相关。本研究使用凋亡常用的检测方法TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labeling)和DAPI双染法,定性分析日本血吸虫14天童虫虫体细胞凋亡现象。应用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)(Annexin V/PI)技术定量分析14天和23天日本血吸虫虫体细胞的凋亡比例,采用商业化哺乳动物凋亡关键分子Caspase3和Caspase7活性检测试剂盒检测日本血吸虫虫体Caspase3和Caspase7的活性,结果显示童虫期虫体的活性高于成虫,雄性成虫的活性高于雌性成虫,相应的结果得到qPCR验证。研究发现,广谱的凋亡抑制剂caspase peptide inhibitor(Z-VAD-FMK)对日本血吸虫虫体的Caspase3/7(?)性有着很好的抑制作用。通过对不同期别日本血吸虫凋亡相关基因的qPCR分析,进一步明确了日本血吸虫可能存在的凋亡通路。这些结果为深入探析miRNA在血吸虫凋亡中的调节作用,日本血吸虫与宿主的相互作用以及开发抗日本血吸虫新药物奠定了基础。二、日本血吸虫感染不同适宜性啮齿类宿主后组织miRNA表达谱变化BALB/c小鼠是日本血吸虫的适宜宿主。本研究利用miRNA芯片技术,检测日本血吸虫感染前和感染10天后小鼠的miRNA表达谱变化,共检测到220个miRNA,其中在肝脏、脾脏和肺脏上调差异表达的分别有8、8和28个,下调差异表达的分别有3、5和23个。这些差异表达miRNA分子的功能主要集中于免疫应答、营养代谢、细胞分化、凋亡及其他信号通路。对这些差异表达niRNA的靶基因进行GO分类和KEGG分析,表明靶基因与多个信号通路有关,如Toll-like受体信号通路、TGF-β信号通路。研究结果揭示了miRNA在日本血吸虫早期感染中可能发挥了重要的生物学功能,并影响着日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生长发育及存活。大鼠是日本血吸虫的非适宜宿主,本研究使用了包含大鼠成熟体miRNA的芯片,分析大鼠在感染血吸虫前和感染10天后肝脏、脾脏和肺脏的miRNA的表达谱差异。结果在大鼠肝脏、脾脏和肺脏中分别鉴定了16个、61个和10个差异表达miRNA.对这些差异表达miRNA分析表明,其功能覆盖了多个生物学过程,如Wnt和MAPK信号传导、细胞内分化和脂肪细胞及红细胞的分化。研究表明miRNA在血吸虫感染大鼠中的调节作用与在小鼠和东方田鼠中的调节作用均存在较大的差别,这最终也影响了血吸虫在大鼠体内的生长发育状况。东方田鼠是至今报道的唯一对日本血吸虫具有天然抗性的哺乳类动物宿主,东方田鼠对日本血吸虫的天然抗性可能与miRNA介导的基因表达及调控相关。HE染色分析表明,东方田鼠感染日本血吸虫后不同组织病理变化与BALB/c小鼠差异显著；miRNA芯片分析表明,在东方田鼠和小鼠肝脏、脾脏和肺脏组织中共检测到388个miRNA,分别有11、25和28个miRNA分子呈现差异表达。这些研究结果显示在东方田鼠体内miRNA特异性地调节一些重要的信号分子通路,如炎症反应、免疫调节、营养代谢等,这些差异表达的miRNA分子可能与东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关。