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研究背景胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,虽然手术结合放化疗的治疗方式已经很成熟,但预后一直很差。其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤5年生存率仅为5.5%,具有高致死率和高复发率的特点,这很大程度上是因为胶质瘤具有高度的异质性。胶质瘤的异质性包括肿瘤间的异质性和肿瘤内的异质性。不同胶质瘤患者来源的肿瘤组织可以分为不同的形态病理学亚型或者分子亚型,而同一患者的肿瘤组织也可以根据位置不同能被分为不同的形态病理学亚型或者分子亚型。高度的异质性被认为是高级别胶质瘤抗药性和高复发率的主要原因,也成为了胶质瘤治疗的一个瓶颈。肿瘤干细胞概念的提出对于应对胶质瘤异质性的挑战提供了希望。由于肿瘤干细胞被认为能够起始和重建肿瘤异质性且对放化疗等治疗措施表现出明显的耐受性,因此被视作肿瘤发生、演进以及迁移复发的种子和首选的靶向治疗目标,成为胶质瘤研究领域的热点。然而,目前对肿瘤干细胞的细胞身份还不明确,因此阻碍了其在转化医学和临床治疗上的应用。而找到肿瘤细胞起源被认为是理解肿瘤异质性很重要的一个方面,也为设计胶质瘤新的治疗方案带来了希望。我们团队和其他研究团队利用小鼠遗传学胶质瘤模型的研究结果提示,少突胶质前体细胞(以下简称“OPC”,胶质细胞的一种类型)在恶性胶质瘤中扮演了一个重要的细胞起源角色。我们最近的研究进一步发现,OPC起源的小鼠胶质瘤中存在OPC样的肿瘤细胞,这些细胞来源于正常OPC,又具有肿瘤干细胞的特征,在体外能增殖和分化,移植到小鼠脑中又能起始肿瘤。利用福尔马林固定石蜡包埋的组织样本,我们发现Olig2阳性的肿瘤细胞亚群广泛存在于不同级别的胶质瘤患者中,这些细胞同时作为肿瘤中主要的增殖细胞类群。鉴于Olig2是正常大脑中OPC 一个稳定的细胞标志物,我们观察到的这些结果至少提示了Olig2阳性的肿瘤细胞亚群也许和正常OPC具有一些相似的特征。因此,这些OPC样的肿瘤细胞可能在人胶质瘤中扮演了重要的角色,深入剖析胶质瘤中这类细胞的细胞学特征和生物学功能,对胶质瘤的基础研究和临床转化都具有重大的意义。研究目的:探究OPC样肿瘤细胞在人不同级别胶质瘤中的细胞身份、形态、分布等细胞特征,以及具有哪些生物学功能,与胶质瘤恶性程度、异质性、亚型、肿瘤干细胞之间的关系。研究方法:(1)、建立适合高分辨率组化分析的人胶质瘤冰冻组织样本库,去除人脑组织中的自发荧光,建立针对人脑(正常或肿瘤)组织的多重免疫荧光染色分析方法。(2)、选取不同级别(Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级)人胶质瘤患者进行多重免疫荧光染色分析,观察OPC特征性标志物Olig2、PDGFRa、NG2、Sox10等共表达情况,及其与增殖细胞标志物Ki67、干细胞标志物Sox2、星形细胞标志物GFAP等的共染情况。进行统计分析,计算OPC样肿瘤细胞的分布、增殖比例等。(3)、建立人胶质瘤细胞的原代培养体系,观察OPC样肿瘤细胞在原代培养细胞系中以及小鼠移植瘤模型中的特征。(4)、建立从人胶质瘤新鲜组织中分离纯化OPC样肿瘤细胞的实验方法“免疫富集”(Immunopanning),用RT-PCR和RNA转录组测序的方法对“OPC样细胞”和“非OPC样细胞”进行分析,一方面验证“免疫富集”(Immunopanning)方法的可靠性和实用性,另一方面从RNA转录组水平观察OPC样肿瘤细胞的特征。(5)、对纯化得到的“OPC样细胞”和“非OPC样细胞”进行体外成球实验,细胞增殖分化能力的实验,探究OPC样肿瘤细胞在体外是否具有干细胞的特性。(6)、将纯化得到的“OPC样细胞”和“非OPC样细胞”分别原位移植到免疫缺陷小鼠脑子里,观察各自起始肿瘤的能力,以此探究OPC样肿瘤细胞在体内是否具有干细胞的特性起始肿瘤。研究结果:(1)、成功建立了 一个适合高分辨率组化分析的人脑(正常或肿瘤)冰冻标本库,并且成功建立了一套稳定的针对人脑(正常或肿瘤)组织的多重免疫荧光染色分析方法。(2)、多重免疫荧光染色分析结果显示,不同级别人胶质瘤中有40～50%细胞是Olig2阳性的,这一个细胞类群中有30～40%左右同时表达了 OPC高度特意的细胞标志物PDGFRa,具有OPC的特征;在增殖分裂(Ki67阳性)的细胞中,Olig2和PDGFRa共阳性的细胞占了 30～50%;几乎所有的PDGFRa阳性细胞都是Olig2阳性的,也是Sox2阳性的,Sox2是表征干细胞的一个标志物。(3)、成功建立人胶质瘤原代培养体系,同时发现OPC样肿瘤细胞存在于原代培养后的细胞系中以及小鼠移植瘤模型中,并维持了活跃增殖的能力。(4)、成功建立一个从人胶质瘤新鲜组织中稳定地分离纯化OPC样肿瘤细胞的实验方法“免疫富集”(Immunopanning)。RT-PCR的结果显示,相比“未纯化细胞”和“非OPC样细胞”,“OPC样细胞”表达了更高水平的正常OPC特征基因包括PDGFRa、Olig2、NG2、NKX2.2。RNA转录组测序的数据显示,相比“非OPC样细胞”,“OPC样细胞”表达了更高水平的其它一些正常OPC特征基因包括PDGFRa、NG2、SOX10、DLL3、PLP1、CLDN11、MBP。单样本基因集富集分析(ssGSEA)分析结果显示“OPC样细胞”相比“非OPC样细胞”富集了胶质母细胞瘤前神经元亚型的特征基因。(5)、体外实验结果显示,从人胶质瘤新鲜组织中纯化下来的OPC样肿瘤细胞在具有体外成球的能力,而且具有增殖分裂的能力。研究结论:OPC样肿瘤细胞广泛存在于不同级别胶质瘤患者中,是一类重要的增殖细胞类群,具有肿瘤干细胞的特性,可能在人胶质瘤中扮演了非常重要的角色。