论文部分内容阅读
反式脂肪酸对健康的影响是长期以来公众关注的焦点,也是科学研究者研究的重点。大量的流行病学研究及临床研究发现工业氢化反式脂肪酸(ITFA)对人体健康有不利的影响,主要包括提高血脂含量,引发动脉粥样硬化,进而引发心血管疾病(CHD)。但关于另一种反式脂肪酸-反刍动物反式脂肪酸(RTFA)的研究却无定论,其是否与ITFA具有类似的健康影响,是否有一个安全摄入阈值等问题仍在广泛研究。有研究表明在一定浓度时,RTFA和ITFA对CHD的影响不同,这不同影响主要由于两者中异构体的结构不同,RTFA主要异构体反异油酸(VA)是11t 18:1,ITFA主要异构体反油酸(EA)是9t 18:1。但是,目前对这样的差别没有明确的生物学解释。关于反式脂肪酸对健康影响的研究大多集中于游离脂肪酸和含有反式脂肪酸的膳食为原料,目前没有关于直接比较VA和EA以纯甘油三酯形态作用的代谢研究。而研究发现,两种反式脂肪酸在甘油三酯中的位置分布不同,那位置的分布是否影响两种反式脂肪酸对健康的影响,这对指导合理膳食有着非常重要的意义。磷脂是细胞膜的主要组成成分,它的结构异常将直接改变细胞膜结构,造成细胞功能异常。甘油三酯作用细胞后,会影响细胞膜磷脂脂肪酸组成,造成细胞和血管功能异常,那么反式脂肪酸甘油三酯OOV和OEO对内皮细胞膜磷脂的影响到底有什么差别,是否会通过影响细胞磷脂从而影响内皮细胞功能是我们的研究方向与重点。因此,本课题通过模仿膳食中反刍动物反式脂肪酸和工业氢化油反式脂肪酸在甘油三酯中的构型,合成了含有11t 18:1的反式脂肪酸甘油三酯OOV,通过MTT法、LDH渗出率、NOS-NO系统以及炎症因子的表达量评估含有两种不同来源反式脂肪酸的甘油三酯OOV与OEO对内皮细胞功能的影响;基于磷脂组学技术,考察了两种反式脂肪酸甘油三酯对内皮细胞膜磷脂的影响,通过PCA和OPLS-DA等多元统计学分析方法找出显著性差异磷脂代谢物,从而进行KEGG通路分析,找出与差异代谢物相关的代谢通路。通过差异磷脂找出差异磷脂酶,用Western Blot分析磷脂酶与炎症因子前列腺素的关系。得到的研究成果如下:1、以游离脂肪酸和丙酮缩甘油为底物研究非对称结构酯OOV的合成方法。首先,以高纯浓度的反异油酸和丙酮酸甘油为底物,在Nozym435脂肪酶的催化下合成1-反异油酸丙酮酸甘油酯,得到的丙酮缩甘油酯在酸性的Amberlyst-15树脂催化下用甲醇裂解得到单甘酯。进一步用溶剂结晶法对得到的单干酯进行分离提纯,得到纯度为91%的单甘酯。纯化后的单甘酯与油酸在催化剂的化学催化下合成OOV。探究了反应温度、反应时间、底物比例和添加剂比例对产物中TAGs含量的影响。单因素实验结果显示,该化学反应合成TAGs的最优条件为:反异油酸单甘油酯与油酸的底物摩尔比为1:2.2,加入化学催化剂DCC(失水剂),DMAP(酰化)(1:0.08),在5ml氯仿中,在30℃下反应3h。在该条件下,TAGs的纯度为97%。用气相色谱法对OOV脂肪酸组成进行测定,确定其结构为OOV,验证了合成方法的合理性。2、通过MTT法、LDH渗出率、NOS-NO系统以及炎症因子的表达量评估含有两种不同来源反式脂肪酸的甘油三酯OOV与OEO对内皮细胞功能的影响。结果表明,在400μmol/L时,OOV和OEO均能使细胞活力受到损伤,能够提高细胞膜渗透性,会通过降低NOS酶活力抑制NO的产生,从而促发炎症。同时使得炎症因子ICAM-1、VCAM-1和IL-6的表达量升高,但是相比于OOV,OEO对细胞的损伤更为明显,一部分原因可能是由于OEO的吸收率高于OOV,另一部分原因是因为少量的11t18:1会转化为CLA,而CLA具有抗炎,抗动脉粥样硬化的效果。这是导致他们对细胞损伤差异的原因。3、基于UPLC-MS/MS(QE Plus?)液相色谱质谱系统的非靶向磷脂组学分析平台,对不同反式脂肪甘油三酯作用内皮细胞后的脂质提取物进行分析,从PCA实验结果可以看出,当不同的甘油三酯作用细胞后,细胞膜磷脂的组成发生变化。经过OPLS-DA以及火山图等分析出OOV与OEO两组显著性差异磷脂代谢物共有8种,分别是PEGPEtn(21:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PE(22:0/24:1)、GPEtn(21:0/24:0)[U]、GPEtn(18:1(9E)/18:1(9E))[U]、PE(16:0/18:1)、PE(18:0/22:6)、PE(18:0/20:4)、GPEtn(15:0/16:0)[U]。与OOV相比,OEO组这八种PE的含量都提高了2倍以上(P<0.05)。根据上述差异磷脂代谢物,进行KEGG通路分析,得到8条差异代谢通路。其中我们更关注的是甘油磷脂代谢(P<0.01)、亚油酸代谢(P<0.05)、α-亚麻酸代谢(P<0.05)以及花生四烯酸代谢(P<0.05)。4、通过Western Blot测定不同反式脂肪酸甘油三酯对人脐静脉内皮细胞磷脂酶的影响并探讨了磷脂酶与前列腺素之间的关系。结果表明,OEO、OOV以及OOO作用HUVEC后,都会使得HUVEC三种磷脂酶A2蛋白表达量升高。其中OEO对sPLA2表达影响更为显著,OOV对iPLA2表达影响更为显著(P<0.05)。此外,OOV更易激活cPLA2的磷酸化水平。磷脂酶A2调节反式脂肪酸甘油三酯诱导HUVEC细胞炎症反应。与单独用反式脂肪酸甘油三酯诱导HUVEC相比,加入三种磷脂酶A2抑制剂PYR(cPLA2抑制剂)、BEL(iPLA2抑制剂)和DTT(sPLA2抑制剂)前处理HUVEC 1 h后,再用OEO和OOV诱导HUVEC,细胞内炎症因子前列腺素分泌显著下降。