【摘 要】
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倍半萜类化合物是一类具有广泛应用的植物源天然产物,其碳链骨架由3个异戊二烯单元组成,多为具有15个碳原子的不饱和链状/环状烯烃。由于其特殊的分子结构和生理活性,目前被广泛应用于食品、医药、精细化工等行业。多环倍半萜是指分子中含有1个以上环状结构的倍半萜类化合物,由于其结构特殊性,常被用于药物、营养化学品、香料等高值化合物合成前体,如与青蒿素结构接近的紫穗槐-4,11-二烯,被用于青蒿素合成过程且受
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倍半萜类化合物是一类具有广泛应用的植物源天然产物,其碳链骨架由3个异戊二烯单元组成,多为具有15个碳原子的不饱和链状/环状烯烃。由于其特殊的分子结构和生理活性,目前被广泛应用于食品、医药、精细化工等行业。多环倍半萜是指分子中含有1个以上环状结构的倍半萜类化合物,由于其结构特殊性,常被用于药物、营养化学品、香料等高值化合物合成前体,如与青蒿素结构接近的紫穗槐-4,11-二烯,被用于青蒿素合成过程且受到广泛关注。但长期以来,由于其结构复杂性,多环倍半萜类化合物的生产方法主要以植物提取为主,但提取过程普遍需要消耗大量溶剂而易造成环境污染且提取产物多为混合物。因此,如何实现倍半萜类化合物高纯度绿色合成成为目前该方向的研究热点。生物合成具有专一性强、产品纯度高等特点。近年来,合成生物学技术的快速发展使异源表达生物合成途径成为天然产物高效合成的重要手段。因此,本研究以实现多环倍半萜类化合物高纯度绿色合成为目的,首先进行了适用于多环倍半萜合成的底盘菌株（BFSC0001）构建,并在该底盘中进行了多种倍半萜合酶表达验证,进一步地,针对具有重要应用前景的紫穗槐-4,11-二烯合酶表达进行了温度敏感型调控探索,研究取得的结果如下:（1）构建了1株强化甲羟戊酸途径的酿酒酵母底盘菌株。以具有内源甲羟戊酸（Mevalonate,MVA）途径的CEN.PK 113-5D酿酒酵母为出发菌株,敲除GAL80使其可利用廉价葡萄糖碳源,并完成MVA途径8个关键酶的过表达,增加了倍半萜前体供应,前体通量提高45倍。（2）完成了14种倍半萜合酶在所构建酿酒酵母底盘中表达,获得12种倍半萜产物并完成产物定性定量,其中紫穗槐-4,11-二烯摇瓶发酵产量为68 mg/L（出发菌株产量161倍）。为验证其倍半萜合成能力,本研究利用强化MVA途径的酿酒酵母为底盘菌株对具有重要潜在应用前景的14种倍半萜合酶进行了表达,选择不同来源、不同骨架结构的倍半萜合酶进行适应性发酵验证,通过GC-MS进行定性分析,并利用标准曲线法对倍半萜产物进行定量,为其后续应用菌株的构建奠定基础,其中,2.5 L发酵罐中紫穗槐-4,11-二烯产量可达1.3 g/L。（3）完成了紫穗槐-4,11-二烯合酶（Amorpha-4,11-diene synthase,ADS）表达温度敏感型调控策略探索,应用该策略可使发酵罐水平紫穗槐-4,11-二烯产量提高2倍。鉴于异源蛋白ADS的表达会干扰宿主细胞代谢,前体FPP和部分次级代谢产物的积累存在细胞毒性,影响细胞生长和蛋白表达,本研究选择突变体GAL4M9代替GAL4作为GAL系列启动子的调节因子,通过构建不同启动子的GAL4M9表达盒来平衡整体代谢通量,在不同温度模式下进行摇瓶发酵验证,发现30℃/26℃下BFSC0001Δ-p CYC1效果最好,96 h摇瓶紫穗槐-4,11-二烯产量达到216 mg/L,2.5 L发酵罐产量最终达到4 g/L,较单一温度发酵提升了2倍,实现了温度控制的两阶段发酵,减轻代谢负担的同时增加了产物的积累。综上,本研究构建了一株适用于多环倍半萜生产的强化MVA途径酿酒酵母底盘菌株,并在此基础上完成了14种倍半萜合酶表达,获得12种倍半萜产物并分别完成其定性定量表征,其中紫穗槐-4,11-二烯摇瓶发酵产量为68 mg/L（出发菌株产量161倍）。为进一步提高紫穗槐-4,11-二烯产量,论文探索了温度敏感型调控策略对倍半萜合酶表达影响,所构建的基于温敏型调控策略的酿酒酵母工程菌株,在30℃/26℃下可获得紫穗槐-4,11-二烯最高产量,2.5 L发酵罐产量可达4 g/L,较单一温度发酵提升了2倍,具有进一步应用推广的潜力。
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