近年来的干细胞研究为组织修复提供了新的治疗手段。要把干细胞有效、安全地应用于临床,必须进行深入的机理研究和大量的在体与离体实验,需要大量的人源干细胞作为实验材料。人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)是从人类早期胚胎内细胞团分离出来的高度未分化的全能性细胞,在体外培养中可保持不分化状态而无限增殖,并经诱导可分化为不同类型的组织细胞,因此人胚胎干细胞建系后可作为理想的实验材料而用于医学、生物学、药学等方面的研究。hESC研究的最大制约因素,是胚胎来源有限。在人类的体外受精—胚胎移植(invitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)的过程中,常常会观察到产生无核碎片的胚胎。这种有碎片胚胎的发育潜能受限,移植后很少获得妊娠,故患者通常会放弃这种胚胎。这些被放弃的胚胎可以用于人胚胎干细胞研究。低评分的人胚胎经去碎片处理后,发育潜能可以得到明显提高。表观遗传学状态与卵裂球的发育潜能有关。H3R26甲基化水平最高的卵裂球会形成内细胞团,而甲基化水平低的卵裂球主要形成滋养外胚层。我们准备利用碎片超过胚胎体积50%以上的四级人胚胎,采用酶消化的方法去除胚胎透明带后,分散卵裂球,去除胚胎碎片,观察胚胎发育潜能的变化,并在获得囊胚后,尝试进行人胚胎干细胞建系工作。此外,选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为目的蛋白,观察体外合成的EGFP-mRNA在小鼠胚胎中的表达情况,为今后以mRNA显微注射的方式人为干预卵裂球发育潜能打好实验基础。与动物克隆的巨大成功相比,人类体细胞核移植(SCNT)研究的进展相当缓慢,其主要限制因素是人类卵子受到法律和伦理学的限制而难以获得。除了卵子,受精卵的胞质也可以支持体细胞的重编程。在人类IVF中常见的多精受精卵可以作为核移植受体而用于核移植研究,从而解决人类SCNT研究的瓶颈因素。已有研究者利用人多精受精卵进行了SCNT研究,但克隆胚胎的发育没有超过8细胞期。克隆胚胎发育潜能受限,至少部分原因是重编程不完全。以DNA甲基转移酶抑制剂(如5-氮杂胞苷)来部分擦除已有的表观遗传学标记,有利于克隆胚胎的发育。我们利用人的多精受精卵为受体,人颗粒细胞为核供体,尝试更为简捷有效的方法进行人类体细胞核移植,并以5-氮杂胞苷对克隆胚胎进行处理,观察其发育潜能的变化,验证DNA甲基化水平的降低是否有利于克隆胚胎的发育。第一部分人胚胎去碎片培养方法：(1)去碎片处理。以链酶蛋白酶消化人胚胎透明带,在无钙镁培养液中分散卵裂球,以植物血凝素(PHA)处理卵裂球2小时,使卵裂球相互接近,然后对卵裂球进行培养,直至形成囊胚。(2)人胚胎干细胞建系。分离囊胚内细胞团,进行原代克隆培养并连续传代。结果：(1)对各组人胚胎进行培养后,均可达到囊胚期。对照组与PHA处理组的囊胚发育率无差异(分别为30.0%、35%与36.4%),而单纯去碎片组的囊胚发育率明显降低(11.5%)。(2)对原代克隆进行培养后,继续传代未超过5代,未能获得人胚胎干细胞系。结论：(1)对低评分人胚胎进行去碎片操作后,能够获得高质量囊胚。(2)PHA处理对于分散的卵裂球的发育有利。第二部分对小鼠胚胎进行mRNA显微注射的实验性研究方法：(1)构建pcDNA3.0-EGFP重组质粒。(2)体外合成EGFP-mRNA。(3)收集小鼠2细胞期胚胎,显微注射EGFP-mRNA,并观察胚胎发育情况及荧光表达情况。结果：(1)与对照组相比,接受mRNA(无论是否加polyA尾)显微注射的小鼠胚胎发育到囊胚的比率略有下降,但无统计学意义(囊胚发育率：对照组64.41%；未加polyA尾注射组48.98%；加polyA尾注射组55.74%)。(2)注射未加polyA尾的EGFP-mRNA后,小鼠胚胎没有表达绿色荧光；注射加polyA尾的EGFP-mRNA后,小鼠胚胎表达绿色荧光的比率增加到36.07%,R组与RA组之间表达荧光的比率差异有统计学意义,而囊胚发育率的差异则无统计学意义。结论：(1) mRNA显微注射本身并不影响胚胎的发育潜能。(2) mRNA在细胞内顺利表达的关键是体外合成时是否成功添加合适长度的polyA尾。第三部分利用人多精受精卵进行核移植方法：实验分组设计如下：PSZ-C:对照组1,不进行任何操作而直接培养,以验证培养体系的有效性；PSZ-H:以Hoechst33342进行染色后,用紫外线进行短暂观察,以排除核染色与紫外线照射对胚胎发育的影响；EO：在间期去除3个原核中的一个,以验证显微操作对胚胎发育的影响；NT：颗粒细胞核移植组,未经5-氮杂胞苷处理;NT-Aza:颗粒细胞核移植组,经0.01mM5-氮杂胞苷处理。(1)核移植。在有丝分裂间期去除人多精受精卵的细胞核,以显微注射方式把人颗粒细胞的细胞核注射到去核的受精卵中,按照分组接受或不接受5-氮杂胞苷的处理,进行胚胎培养。(2)收集分裂期的人类多精受精卵(PSZ-C)、经过5-氮杂胞苷处理的分裂期的核移植胚胎(NT-AZA-C)以及未经5-氮杂胞苷处理的分裂期的核移植胚胎(NT-C),进行5-甲基胞嘧啶免疫荧光染色,以共聚焦显微镜观察荧光并拍照,以ImageJ软件分析荧光强度。结果：(1)颗粒细胞的细胞周期分布。72.6+6.0%的颗粒细胞为G0/G1期。(2) PSZ-C组单纯培养后获得4个囊胚,囊胚发育率为11.1%。PSZ-H组获得1个囊胚,囊胚发育率为7.7%。EO组获得4个囊胚,囊胚发育率为12.9%。各组的8细胞期胚胎发育率与囊胚发育率的差异均无统计学意义。(3)核移植的胚胎发育没有超过8细胞期。在NT-CB组中对29枚胚胎进行了操作,存活率为48.3%,卵裂率为21.4%,没有发育到8细胞期的胚胎；在NT组中对61枚胚胎进行了操作,存活率为73.8%,卵裂率为48.9%,发育达到8细胞期的比率为11.1%；在NT-Aza组中对64枚胚胎进行了操作,存活率为81.3%,卵裂率为65.4%,发育达到8细胞期的比率为32.7%。NT-CB组的胚胎存活率、卵裂率和8细胞期发育率均低于其余两组。NT和NT-Aza组在8细胞期的胚胎发育率方面的差异具有统计学意义。(4) NT-AZA-C和NT-C组之间荧光强度的差异有统计学意义,NT-AZA-C组的荧光强度明显降低,但仍未降至PSZ-C组的水平。(5)核移植胚胎出现异常的核分裂模式。结论：(1)颗粒细胞的细胞周期状态适于核移植。(2)本实验的培养体系条件适宜。(3) Hoechst33342染色及短时间的紫外线照射不影响胚胎发育。(4)5-氮杂胞苷处理有利于核移植胚胎的发育。(5)表观遗传学状态的异常与核分裂模式的异常是核移植胚胎发育潜能受限的重要原因。小结1、对低评分人胚胎进行去碎片操作后,能够获得高质量囊胚。PHA处理对于分散的卵裂球的发育有利。2、mRNA显微注射本身并不影响胚胎的发育潜能。mRNA在细胞内顺利表达的关键是体外合成时是否成功添加合适长度的polyA尾。3、5-氮杂胞苷处理有利于核移植胚胎的发育。表观遗传学状态的异常与核分裂模式的异常是核移植胚胎发育潜能受限的重要原因。