2015年，我们在高等真核生物果蝇中发现DNA N6-甲基腺嘌呤(6mA)新修饰，同时人们在秀丽隐杆线虫基因组中也检测到6mA。此时研究也发现果蝇、哈德莱茵衣藻和秀丽隐杆线虫基因组DNA6mA具有激活基因表达或转座子表达的功能，表明DNA6mA是真核生物中潜在的表观遗传标记。随后，在斑马鱼和非洲爪蟾中也检测到6mA修饰。虽然有报道猪胚胎细胞和小鼠胚胎干细胞中存在DNA6mA，但目前人们对于哺乳动物是否存在DNA6mA这一科学问题仍未得出结论。　　我们以小鼠胚胎干细胞(mESCs)为模型，利用本研究组发展的一种检测6mA的高灵敏度UHPLC-MS/MS方法，寻找哺乳动物DNA6mA。在mES细胞中，我们可检测到6mA，其含量约2.0-6.06mA/107dA。利用细胞周期同步化，发现G1期6mA水平升高，可达1.0-2.66mA/106dA。我们在人胚胎干细胞中也检测到DNA6mA。由此证明了胚胎干细胞中存在6mA。　　利用稳定同位素标记的脱氧腺嘌呤核苷([15N5]-dA)，在mES细胞中没有检测到新的含有同位素标记的6mA，暗示mES细胞中的6mA可能不是由甲基转移酶甲基化产生的;利用[13CD3]L-甲硫氨酸示踪，结果显示＞50％5mdC被标记成[13CD3]-5mC，但仍未检测到[13CD3]-6mA，再次表明mES细胞中的6mA可能不是由甲基转移酶甲基化产生的。　　由以上结果，我们提出一个关键科学问题，小鼠胚胎干细胞中6mA是如何产生的？为此，我们将细胞暴露于RNA m6A核苷、DNA6mA脱氧核苷，均可检测到暴露基因组中6mA的增加。暴露于稳定同位素标记的6mA脱氧核苷([15N5]-6mA)，可在基因组DNA中检测[15N5]-6mA的出现。暴露于含6mA的脱氧寡核苷酸链或含RNA m6A寡核苷酸链，均检测到基因组中6mA的增加。这些结果表明，含N6-甲基腺嘌呤碱基的外源核苷/（脱氧）寡核苷酸在mES细胞中经过一系列的核苷代谢途径可掺入到基因组中。在正常培养的mESC中，我们并未检测到N6-甲基腺嘌呤碱基相关的外源物质。mESC中6mA的产生仍是一个谜，有待进一步深入研究。　　由于在原核生物中DNA6mA的一个主要功能与宿主-病原体的相互作用有关，我们设想病毒的侵入是否可引起哺乳动物基因组6mA的出现。我们以人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的假病毒和常见的慢病毒为模型。HIV-1假病毒基因组gRNA在感染细胞内逆转录成cDNA，然后整合进细胞的基因组DNA中。我们猜想HIV-1假病毒感染细胞的整个过程是否改变宿主DNA甲基化水平，如DNA6mA修饰。结果显示HIV-1假病毒感染Hela细胞后，未检测到DNA6mA水平的变化;慢病毒感染Hela细胞后，6mA呈现从无到有的增加。结果表明，病毒感染有可能产生DNA6mA，但具有病毒种类的依赖性。　　为了理解哺乳动物DNA6mA的来源及其分布与功能，我们需要发展相应的测序技术与方法。利用免疫沉淀法富集含6mA的DNA片段是一个极为关键的步骤。我们分析了五种6mA抗体对Dam-/-lambda DNA的富集效果，富集倍数为5.3-37倍，然而我们发现在最终富集的DNA中含有大量的不含6mA修饰的DNA(73.5-94.6％)。理论上，残存的不含6mA的片段以序列无关的方式随机地与抗体结合，不会被序列分析算法判为6mA峰。实际上，大量不含6mA片段的存在严重干扰6mA峰的判定。为此，发展出一种多重免疫沉淀(MrIP)富集方法。利用这一方法，对Dam-/-lambda DNA中的6mA片段富集。经过两轮富集，每条DNA片段含有一个或两个6mA修饰。对于含有极低6mA丰度的基因组DNA(0.44/106nt)。经过三轮富集后，6mA水平升高约9100倍，可达0.4％(6mA/nt)也就是说最终富集的DNA中有60％的DNA片段中含有6mA修饰，并且富集的DNA质量约13.7ng，已满足DNA文库构建和基因组DNA测序分析的需要。所发展的这种生物化学方法将在很大程度上减少6mA峰有关的偏差，并且有利于6mA相关数据的挖掘，将极大地促进基因组6mA测序分析。类似地，MrIP方法可用于各种DNA修饰的基因组测序。