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背景
超细颗粒物是一种常见的工业物质、也是常见的空气污染物，其粒径小于1μm。由于其粒径较小，因而具有了更加剧烈的生物健康损伤效应。最常见的超细颗粒物就是碳相关的超细颗粒物，碳黑纳米颗粒由于其特殊物理化学性质是最传统且最被广泛运用的材料。多环芳烃中的苯并(a)芘是最典型的代表物质，多存在于煤焦油，通过汽车尾气和燃料燃烧等途径中产生。近年来，碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘在流行病学和毒理学领域已被广泛研究，发现其与呼吸系统、循环系统、心血管系统、内分泌系统、神经系统以及生殖系统均有密切的联系。
碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘被吸入后的主要攻击目标是呼吸系统，环境中的外源化学物很少单独存在，都是以复合物的形式被人体摄入。多项研究表明单独的碳黑纳米颗粒和单独的苯并(a)芘被吸入后可以引起动物呼吸道以及肺部炎症，体外实验也表明，单独的碳黑纳米颗粒和单独的苯并(a)芘可以引起细胞的炎症反应。但是在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露后的疾病结局尚未被研究，并且碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露后细胞或动物的机制也尚未被研究。在水生动物中的研究揭示了mRNA在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露中的作用，但是非编码RNA在在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露中的机制尚未开展。近年来对非编码RNA的研究越来越深入，从miRNA到lncRNA再到circRNA的研究逐渐丰富了表观遗传学的范畴。非编码RNA的功能也逐渐的被完善，其可以在转录调控、转录后调控、RNA修饰、甚至mRNA翻译等方面发挥作用。研究非编码RNA在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露中的功能和机制研究，可以更加深入的解释碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露引起的气道炎症的机制，为更全面认识外源化学物以及非编码RNA调控机制提供新的证据。
circRNA是非编码RNA的研究热点，是由反向剪接过程产生的共价闭合环状RNA，没有3’和5’端，也没有ployA尾巴，在转录和转录后水平均可能具有调控作用。在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露过程中，circRNA的调控作用尚未被报道，我们挑选了具有调控功能的circRNA，检测了其在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘单独暴露以及复合暴露过程中的调控功能，并且研究了其作用的机制，为更深入的了解纳米颗粒物的致气道炎症作用及机制提供了新的观点。方法
碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露引起炎症过程中，主要选择了16HBE细胞、BEAS-2B细胞和BALB/c小鼠为研究对象，通过浓度梯度和时间梯度进行染毒，运用CCK8试剂盒和LDH试剂盒检测细胞的活性，通过炎症因子芯片寻找差异表达的炎症发生因子；通过RT-qPCR、ELISA试剂盒和白细胞粘附实验，验证差异表达的炎症情况。运用HE染色和免疫组化实验，评估碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露小鼠肺部炎症发生情况。
使用高通量测序挑选差异表达的circRNA，结合FISH实验，对circRNA进行胞浆胞核定位，又通过干扰/过表达实验，验证了circFAM117的抑炎功能。进而通过双荧光素酶报告基因实验，确定了circFAM117和miR-204-5p、miR-204-5p和IL-11的互作关系；与此同时过表达了circFAM117和miR-204-5p进一步阐明了circFAM117和miR-204-5p的互作作用。最后，通过Westernblot实验检测炎症通路相关蛋白的变化情况。
结果
透射电镜下观察发现，CBNPs和BaP-CBNPs这两种纳米颗粒物可以进入16HBE细胞和小鼠的肺组织中；在24-72h时间梯度上，CBNPs和BaP-CBNPs在2.5μg/ml-80μg/ml染毒浓度梯度上，BaP在2.5ng/ml-80ng/ml染毒浓度梯度上可以抑制细胞活力(p＜0.05)，并呈现剂量依赖关系，且BaP单独暴露组抑制效应更强(p＜0.05)。炎症因子芯片结果通过聚类分析显示，CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露组中的IL-6、IL-11和ICAM-1均分在了同一组(p＜0.05)。并且BaP单独暴露组具有引起更广泛的炎症因子改变的能力(p＜0.05)；IL-6、IL-11和ICAM-1在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露组中表现出一定的共性。染毒72h后，IL-6、IL-11和ICAM-1在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露下，mRNA和蛋白水平呈剂量时间依赖升高现象(p＜0.05)，暴露72h后，BaP染毒组较其他两组粘附的U937细胞更多(p＜0.05)。
通过计算现实暴露剂量对小鼠进行染毒，CBNPs和BaP-CBNPs组采用8ng/d和80ng/d的染毒剂量、BaP组采用0.008ng/d和0.08ng/d的染毒剂量，鼻滴注7d和14d。提取小鼠肺组织RNA后，检测IL-6、IL-11和ICAM-1在mRNA水平的表达，结果显示在mRNA水平IL-6、IL-11和ICAM-1随着时间和剂量梯度升高(p＜0.05)。对小鼠肺泡灌洗液进行ELISA检测后，结果显示在蛋白水平IL-6、IL-11和ICAM-1均升高(p＜0.05)。我们对病理切片进行了评分，结果显示，BaP高暴露组得分高于其他组(p＜0.05)。免疫组化结果显示，无论在低暴露组还是在高暴露组，BaP染毒组的IL-6、IL-11和ICAM-1的蛋白指标均较其他两组碳黑纳米颗粒组更高(p＜0.05)。
通过高通量测序，我们找到了在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs染毒组呈现高表达的基因circFAM117，通过干扰circFAM117联合CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露后，发现相比于Scrambled联合外源化学物暴露组，细胞活力升高(p＜0.05)；过表达circFAM117联合外源化学物暴露后，相比于Vec联合外源化学物暴露组，16HBE细胞活力降低(p＜0.05)。干扰circFAM117联合CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露后，相比于Scrambled联合外源化学物暴露组，IL-6、IL-8以及ICAM-1在mRNA和蛋白水平的表达降低(p＜0.05)；过表达circFAM117联合外源化学物暴露后，相比于Vec联合外源化学物暴露组，IL-6、IL-8以及ICAM-1在mRNA和蛋白水平的表达升高(p＜0.05)。同时，在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露16HBE细胞后，IL-6、IL-11和ICAM-1在Scrambled+BaP/Vec+BaP组mRNA水平和蛋白水平上的表达量明显高于Scrambled+CBNPs/Vec+CBNPs和Scrambled+BaP-CBNPs/Vec+BaP-CBNPs组(p＜0.05)。结果显示circFAM117在CBNPs和BaP-CBNPs暴露后的促炎功能。
通过双荧光素酶报告基因实验，我们发现，circFAM117与miR-204-5p可以直接结合，并存在着反向调控关系；miR-204-5p可以与IL-11直接结合，并存在着反向调控关系。单独过表达circFAM117时，IL-11、IL-6和ICAM-1在蛋白和mRNA水平上表达升高(p＜0.05)；单独过表达miR-204-5p时，IL-11、IL-6和ICAM-1在蛋白和mRNA水平上表达降低(p＜0.05)；而同时过表达circFAM117和miR-204-5p时，在蛋白和mRNA水平的表达效应介于单独过表达这两个基因之间(p＜0.05)。单独过表达circFAM117时，p-STAT3在各染毒组表达升高(p＜0.05)；单独过表达miR-204-5p时，p-STAT3在各染毒组表达降低(p＜0.05)；而同时过表达circFAM117和miR-204-5p时，p-STAT3在各染毒组表达介于单独过表达这两个基因之间(p＜0.05)。
结论
1.CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露可引起16HBE细胞、BEAS-2B细胞和BALB/c小鼠炎症反应。
2.相比与CBNPs和BaP-CBNPs暴露组，BaP暴露具有更强的致炎作用。3.在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs致16HBE细胞炎症过程中，circFAM117具有促炎基因的功能。
4.CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露致16HBE细胞炎症过程中，circFAM117靶向miR-204-5p，通过IL-11/STAT3轴发挥促炎作用。
超细颗粒物是一种常见的工业物质、也是常见的空气污染物，其粒径小于1μm。由于其粒径较小，因而具有了更加剧烈的生物健康损伤效应。最常见的超细颗粒物就是碳相关的超细颗粒物，碳黑纳米颗粒由于其特殊物理化学性质是最传统且最被广泛运用的材料。多环芳烃中的苯并(a)芘是最典型的代表物质，多存在于煤焦油，通过汽车尾气和燃料燃烧等途径中产生。近年来，碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘在流行病学和毒理学领域已被广泛研究，发现其与呼吸系统、循环系统、心血管系统、内分泌系统、神经系统以及生殖系统均有密切的联系。
碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘被吸入后的主要攻击目标是呼吸系统，环境中的外源化学物很少单独存在，都是以复合物的形式被人体摄入。多项研究表明单独的碳黑纳米颗粒和单独的苯并(a)芘被吸入后可以引起动物呼吸道以及肺部炎症，体外实验也表明，单独的碳黑纳米颗粒和单独的苯并(a)芘可以引起细胞的炎症反应。但是在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露后的疾病结局尚未被研究，并且碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露后细胞或动物的机制也尚未被研究。在水生动物中的研究揭示了mRNA在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露中的作用，但是非编码RNA在在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露中的机制尚未开展。近年来对非编码RNA的研究越来越深入，从miRNA到lncRNA再到circRNA的研究逐渐丰富了表观遗传学的范畴。非编码RNA的功能也逐渐的被完善，其可以在转录调控、转录后调控、RNA修饰、甚至mRNA翻译等方面发挥作用。研究非编码RNA在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露中的功能和机制研究，可以更加深入的解释碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露引起的气道炎症的机制，为更全面认识外源化学物以及非编码RNA调控机制提供新的证据。
circRNA是非编码RNA的研究热点，是由反向剪接过程产生的共价闭合环状RNA，没有3’和5’端，也没有ployA尾巴，在转录和转录后水平均可能具有调控作用。在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露过程中，circRNA的调控作用尚未被报道，我们挑选了具有调控功能的circRNA，检测了其在碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘单独暴露以及复合暴露过程中的调控功能，并且研究了其作用的机制，为更深入的了解纳米颗粒物的致气道炎症作用及机制提供了新的观点。方法
碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露引起炎症过程中，主要选择了16HBE细胞、BEAS-2B细胞和BALB/c小鼠为研究对象，通过浓度梯度和时间梯度进行染毒，运用CCK8试剂盒和LDH试剂盒检测细胞的活性，通过炎症因子芯片寻找差异表达的炎症发生因子；通过RT-qPCR、ELISA试剂盒和白细胞粘附实验，验证差异表达的炎症情况。运用HE染色和免疫组化实验，评估碳黑纳米颗粒和苯并(a)芘复合暴露小鼠肺部炎症发生情况。
使用高通量测序挑选差异表达的circRNA，结合FISH实验，对circRNA进行胞浆胞核定位，又通过干扰/过表达实验，验证了circFAM117的抑炎功能。进而通过双荧光素酶报告基因实验，确定了circFAM117和miR-204-5p、miR-204-5p和IL-11的互作关系；与此同时过表达了circFAM117和miR-204-5p进一步阐明了circFAM117和miR-204-5p的互作作用。最后，通过Westernblot实验检测炎症通路相关蛋白的变化情况。
结果
透射电镜下观察发现，CBNPs和BaP-CBNPs这两种纳米颗粒物可以进入16HBE细胞和小鼠的肺组织中；在24-72h时间梯度上，CBNPs和BaP-CBNPs在2.5μg/ml-80μg/ml染毒浓度梯度上，BaP在2.5ng/ml-80ng/ml染毒浓度梯度上可以抑制细胞活力(p＜0.05)，并呈现剂量依赖关系，且BaP单独暴露组抑制效应更强(p＜0.05)。炎症因子芯片结果通过聚类分析显示，CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露组中的IL-6、IL-11和ICAM-1均分在了同一组(p＜0.05)。并且BaP单独暴露组具有引起更广泛的炎症因子改变的能力(p＜0.05)；IL-6、IL-11和ICAM-1在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露组中表现出一定的共性。染毒72h后，IL-6、IL-11和ICAM-1在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露下，mRNA和蛋白水平呈剂量时间依赖升高现象(p＜0.05)，暴露72h后，BaP染毒组较其他两组粘附的U937细胞更多(p＜0.05)。
通过计算现实暴露剂量对小鼠进行染毒，CBNPs和BaP-CBNPs组采用8ng/d和80ng/d的染毒剂量、BaP组采用0.008ng/d和0.08ng/d的染毒剂量，鼻滴注7d和14d。提取小鼠肺组织RNA后，检测IL-6、IL-11和ICAM-1在mRNA水平的表达，结果显示在mRNA水平IL-6、IL-11和ICAM-1随着时间和剂量梯度升高(p＜0.05)。对小鼠肺泡灌洗液进行ELISA检测后，结果显示在蛋白水平IL-6、IL-11和ICAM-1均升高(p＜0.05)。我们对病理切片进行了评分，结果显示，BaP高暴露组得分高于其他组(p＜0.05)。免疫组化结果显示，无论在低暴露组还是在高暴露组，BaP染毒组的IL-6、IL-11和ICAM-1的蛋白指标均较其他两组碳黑纳米颗粒组更高(p＜0.05)。
通过高通量测序，我们找到了在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs染毒组呈现高表达的基因circFAM117，通过干扰circFAM117联合CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露后，发现相比于Scrambled联合外源化学物暴露组，细胞活力升高(p＜0.05)；过表达circFAM117联合外源化学物暴露后，相比于Vec联合外源化学物暴露组，16HBE细胞活力降低(p＜0.05)。干扰circFAM117联合CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露后，相比于Scrambled联合外源化学物暴露组，IL-6、IL-8以及ICAM-1在mRNA和蛋白水平的表达降低(p＜0.05)；过表达circFAM117联合外源化学物暴露后，相比于Vec联合外源化学物暴露组，IL-6、IL-8以及ICAM-1在mRNA和蛋白水平的表达升高(p＜0.05)。同时，在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露16HBE细胞后，IL-6、IL-11和ICAM-1在Scrambled+BaP/Vec+BaP组mRNA水平和蛋白水平上的表达量明显高于Scrambled+CBNPs/Vec+CBNPs和Scrambled+BaP-CBNPs/Vec+BaP-CBNPs组(p＜0.05)。结果显示circFAM117在CBNPs和BaP-CBNPs暴露后的促炎功能。
通过双荧光素酶报告基因实验，我们发现，circFAM117与miR-204-5p可以直接结合，并存在着反向调控关系；miR-204-5p可以与IL-11直接结合，并存在着反向调控关系。单独过表达circFAM117时，IL-11、IL-6和ICAM-1在蛋白和mRNA水平上表达升高(p＜0.05)；单独过表达miR-204-5p时，IL-11、IL-6和ICAM-1在蛋白和mRNA水平上表达降低(p＜0.05)；而同时过表达circFAM117和miR-204-5p时，在蛋白和mRNA水平的表达效应介于单独过表达这两个基因之间(p＜0.05)。单独过表达circFAM117时，p-STAT3在各染毒组表达升高(p＜0.05)；单独过表达miR-204-5p时，p-STAT3在各染毒组表达降低(p＜0.05)；而同时过表达circFAM117和miR-204-5p时，p-STAT3在各染毒组表达介于单独过表达这两个基因之间(p＜0.05)。
结论
1.CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露可引起16HBE细胞、BEAS-2B细胞和BALB/c小鼠炎症反应。
2.相比与CBNPs和BaP-CBNPs暴露组，BaP暴露具有更强的致炎作用。3.在CBNPs、BaP和BaP-CBNPs致16HBE细胞炎症过程中，circFAM117具有促炎基因的功能。
4.CBNPs、BaP和BaP-CBNPs暴露致16HBE细胞炎症过程中，circFAM117靶向miR-204-5p，通过IL-11/STAT3轴发挥促炎作用。