双组分信号转导系统（Two-component signal transduction system,TCS）是细菌感知和响应周围环境的主要手段,细菌的绝大多数生理过程（例如感知渗透压、营养元素的代谢、细胞壁的合成、细胞的增值和分裂等）都受到双组分系统的调控。双组分信号转导系统在细菌中广泛存在,一些真菌和植物中也发现了一些双组分系统,但是目前为止还未在人类和其他哺乳动物中发现它的存在,双组分系统因此被认为有发展为抗菌药物靶点的潜力。组氨酸激酶（Histidine Kinase,HK）和应答调节蛋白（Response Regulator,RR）是双组分信号转导系统的两个主要组成蛋白。HK能感应环境刺激并将这种刺激信号通过磷酸基团的转移传递给下游的RR,而磷酸化的RR能通过与基因或蛋白质靶标的相互作用调控信号输出,或者通过去磷酸化对细胞调控进行终止。在细菌的双组分信号转导系统中,大多数HK具有多功能性,不仅能实现自身磷酸化并传递磷酸基团给RR蛋白,还能介导催化RR蛋白的去磷酸化。在不同pH条件下,组氨酸激酶HK853胞内全长蛋白（HK853cp）与底物应答调节蛋白RR468形成的复合物的晶体结构存在差异。His260残基是HK853参与去磷酸化反应关键位点,复合物晶体结构显示其咪哇侧链在不同pH下的空间位置明显不同。组氨酸的咪唑侧链在催化反应中常通过不同的质子化状态灵活调控反应进程,但是受限于晶体结构的分辨率,关键残基His260在催化去磷酸化反应时的质子化状态并不清晰。解析His260位点在HK853进行激酶和磷酸酶功能切换时的质子交换过程,是研究HK的酸碱调控机制的关键。核磁共振波谱技术在研究生物大分子之间的相互作用具有优势,但是由于HK853cp与底物RR468形成的复合物分子量超过85 kDa,普通的同位素标记方法无法获得可分辨的NMR信号。本文运用磷酸基团类似物BeF3-获得HK853与RR468的稳定磷酸化复合物,采用选择性标记的方法对HK853 DHp结构域(HK853^DHp)组氨酸残基侧链的ε1-C进行同位素标记,获得了清晰的NMR信号。将不同组氨酸位点分别进行定点突变,对¹H-¹³CHSQC谱图进行了信号归属。¹H-¹³CHSQC的pH滴定实验测定了HK853及其复合物质子交换过程的pKa值,活性位点His260的pKa值变化明显异于其他非活性位点的组氨酸,且该pKa值与去磷酸化实验获得的HK853^DHp行使磷酸酶功能的最佳pH值范围相对应。另外,运用定点突变的方法我们获得了HK853^DHp的一系列突变体,利用去磷酸化功能实验测定HK853^DHp及突变体的磷酸酶活性,结合19F NMR pH滴定的结果,确定了DHp结构域上的另一个保守残基Thr264对HK853的磷酸酶功能的影响。综上所述,本文运用¹³C^ε1-His选择性同位素标记的方法,获得了 HK853及其复合物HK853-BeF₃--RR468的高分辨NMR谱图。通过¹H-¹³CHSQC的pH滴定实验测定其pKa值,确定了 His260位点在HK853行使磷酸酶功能时的质子化状态;通过¹⁹FNMR pH滴定和磷酸酶活性测定确定了 Thr264位点与His260协同作用影响HK853的磷酸酶功能,进一步阐明了组氨酸激酶HK853的酸碱调控机制,为双组分信号转导系统调控机制的研究提供了新的数据,有助于打开新型抗菌药物设计的思路,同时本文运用氨基酸侧链选择性标记研究TCS分子机制的方法为类似蛋白质体系的研究提供了可借鉴的经验。