乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染仍旧是世界范围内严重的公共卫生问题。目前，临床上治疗乙型肝炎的药物主要包括α-干扰素(interferon-α，IFN-α)以及核苷类似物类药物拉米呋啶(1amivudine)和阿地福韦(adefovir dipivoxil)。但现有的治疗方法在大部分患者中均不能完全清除体内的HBV。近年来，基因治疗的研究取得了令人瞩目的成就，这也为乙型肝炎的治疗开辟了新的途径。 乙型肝炎病毒核心蛋白和人嗜酸性粒细胞来源神经毒素融合蛋白基因，或称为乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶基因(HBV targeted ribonuclease gene，以下简称HBV-TR基因)是我室刘军博士等根据核衣壳导向的病毒灭活原理(capsid-targeted viral inactivation，CTVI)构建的融合基因。该基因所表达的融合蛋白由两部分构成：靶向分子为乙型肝炎病毒核心蛋白(HBV core protein，HBc)，是HBV包装过程中必需的成分；效应分子为人嗜酸性粒细胞来源神经毒素(human eosinophil derired neurotoxin，hEDN)，是一种核糖核酸酶。HBV-TR基因在体外实验中可有效地抑制HBV的复制。 为进一步研究HBV-TR基因在体内的表达，以及为该基因在乙型肝炎小动物模型体内的抗病毒功能研究和临床应用研究奠定基础，本课题首先构建了HBV-TR重组腺病毒载体，在HEK293细胞中大量扩增至一定滴度后感染正常小鼠，然后用免疫组织化学的方法研究该重组腺病毒在正常小鼠体内，特别是肝脏的表达状况及其毒性反应。 第四军医大学硕士学位论文 本研究使用AdMax KitD系统完成HBV一TR重组腺病毒载体的构建。首先是构建穿梭质粒(Shuttle plasmid)，免mHI和从ndlll双酶切pcDNA3.1卜)/TR得到TR基因片段，同时用兔Hl和从ndlll双酶切质粒载体pDC3 16，然后用T4 DNA连接酶将TR基因片段插入质粒载体pOC316，从而得到穿梭质粒pDC316/TR。使用相同的方法构建对照组穿梭质粒pDC3 16/TRm、pDC3 16/hEDN和pDC316/HBe。 分别提取穿梭质粒pDC316/TR、pDC316/TRm、pDC316/hEDN、pDC316/HBe、pDC316空载体和辅助质粒(reseue plasmid)pBHGI。x么El，3cre。所有质粒经酚一氯仿抽提和乙醇沉淀后重新溶解于适量的。，1 xTE(pHS.0)中以使其浓度在40 ug/mL左右。然后将各穿梭质粒分别和辅助质粒以磷酸钙法共转染HEK 293细胞，待大部分细胞出现典型的细胞病变(cyt叩athiC effect，C尸E)时，低速离心收集细胞并重悬于PBS中，一70℃/37℃反复冻融、振荡，最后离心收集病毒上清于一70℃保存. 以从转染后获得的重组腺病毒粗提液中提取的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出预期的目的基因片段，从而证明HBV一TR重组腺病毒载体(AdTR)及其对照载体AdTRm、AdhEDN和AdHBC均构建成功。 将AdTR及其对照载体AdhEDN分别在HEK 293细胞中大量扩增至10’‘，pfu/mL，然后用此高滴度的重组腺病毒颗粒以尾静脉注射法分别感染正常小鼠，给药方法为每天1次，连续3天，而正常对照组小鼠仅注射生理盆水。其间，定期观察小鼠的生存状况。于第四天处死小鼠，并取小鼠肝脏常规石蜡包埋、切片。 本研究使用自行制备的兔抗TR融合蛋白多克隆血清对实验组小鼠肝脏进行的免疫组织化学染色结果显示，TR融合蛋白和hEDN蛋白在鼠肝脏均获得了阳性表达，而分别用未免疫正常兔血清和磷酸盐缓冲液代替一抗的染色结果，以及正常对照组鼠肝脏的染色结果均为阴性。此外，实验组小鼠肝脏的HE染色除发现肝组织局部有轻微的淋巴细胞浸润外未发现其它明显的病理变化。 本课题成功构建了乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶基因的重组腺病毒载体AdTR及其对照载体AdTRm、AdhEDN、AdHBC和空的重组腺病毒载体，并扩增获得了高滴度的AdTR和AdhEO、重组腺病毒颗粒;分别感染正常小 第四军医大学硕士学位论文鼠后在其肝脏获得了TR融合蛋白和hEDN蛋白的阳性表达。实验证明，使用人腺病毒载体将目的基因导入小鼠肝细胞的基因治疗方法是高效的、可行的。本研究的结果为HBV一TR重组腺病毒载体下一步在乙型肝炎小动物模型体内的抗病毒作用研究，以及为探索新的乙型肝炎基因治疗方法打下了良好的基础.