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仿刺参(Apostichopus japonicus)是重要经济类棘皮动物。当外界环境不适或遭遇敌害时,身体会发生强烈收缩,把部分或全部的内脏排出体外。吐脏后的仿刺参具有极强的再生能力,在适宜的环境条件下,可再生出功能完善的内脏器官。MSI1(Musashi1)、LGR5(leucine-rich repeat-containing g-protein coupled receptor5)、SDF2(stromal cell derived factor 2)和KIF3A(kinesin family member 3A)作为典型的肠干细胞标记物和细胞增殖与迁移调控蛋白近年来得到深入研究。MSI1蛋白可调节Notch,Wnt/β-catenin信号通路,影响干/祖细胞的细胞增殖。LGR5蛋白可激活Wnt/β-catenin信号通路,使细胞周期加速,从而促进细胞增殖。SDF2和KIF3A则与细胞增殖和迁移关系紧密,可以参与Wnt/β-catenin信号的调节,在细胞增殖和细胞周期等方面均发挥重要作用。但上述基因在仿刺参肠再生过程中的作用尚不清楚,本研究对MSI1、LGR5、SDF2和KIF3A在仿刺参肠再生过程中的作用进行了研究。本研究将为无脊椎动物再生和再生医学研究提供基础资料,具有较为重要的理论意义,对仿刺参的苗种生产及养殖具有潜在的应用价值。本研究采用RACE技术克隆了Aj-msi1、Aj-lgr5、Aj-sdf2和Aj-kif3a基因的序列,并对其进行了生物信息学分析;以Real-time q PCR法分析了各基因在肠再生过程中的表达水平;利用Western Blotting法分析了各基因在肠再生过程中的调控关系;采用免疫组化法分析了各基因的表达部位。研究结果显示,Aj-msi1的ORF序列为1023bp,编码341个氨基酸,Aj-lgr5的ORF序列为2412bp,编码804个氨基酸,Aj-sdf2的ORF序列为456bp,编码152个氨基酸,Aj-kif3a的ORF序列为1704bp,编码568个氨基酸。在基因水平上,Aj-msi1、Aj-lgr5和Aj-kif3a呈现先升高后降低的趋势,在第12天达到峰值;而Aj-sdf2的表达水平则呈现先降低后升高的趋势,在第0天表达量最高。在蛋白水平上,上述蛋白的表达模式均与基因相同,另外,干细胞标记物Aj-CD44和细胞迁移相关蛋白Aj-CDC42与上述蛋白的表达模式类似,也是先升高后降低,唯一区别是Aj-CDC42蛋白表达量在第6天即达到峰值。上述研究结果证明,在仿刺参吐脏初期,Aj-MSI1、Aj-LGR5、Aj-CD44、Aj-CDC42和Aj-KIF3A蛋白上调,Wnt/β-catenin信号通路表达增强,干细胞富集,从而对后续肠道再生所需的细胞增殖进行物质准备。随着肠道雏形的形成,上述蛋白表达量下调,细胞分裂活动减少,开始以细胞分化为主,从而形成功能性肠,最终表达量维持在正常水平。免疫荧光结果显示,在仿刺参肠再生过程的各个时期,上述蛋白在肠道的黏膜和黏膜下层表达量均相对较高,证明再生相关基因重点表达于此处细胞,这些细胞不断增殖分化形成新肠道的各类型细胞。在形成功能完备的肠后,上述蛋白仍重点表达于肠黏膜处,通过不断增殖来补充因为肠道内容物侵蚀而死亡的细胞,维持肠的结构和功能。此外,对肠系膜的干细胞标记结果证实,仿刺参肠再生过程中不断增殖的干性细胞来源于肠系膜,肠系膜在仿刺参肠再生过程中至关重要。