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本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 DAPK1与ERK在神经元缺血再灌注中的激活与结合 目的：探究神经元缺血再灌注后死亡相关蛋白激酶1（Death-associated protein kinase1，DAPK1）以及细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）的激活规律和再灌注所致的神经元凋亡规律，并研究DAPK1与ERK是否存在结合。 方法：本部分实验以小鼠N2a细胞系为主要研究对象、小鼠原代神经元与雄性C57BL/6小鼠作为补充，分别以糖氧剥离试验（Oxygen glucose deprivation，OGD）、兴奋性毒性刺激和大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）为缺血模型，共分为A、B、C三部分。A部分研究神经元缺血再灌注能否激活DAPK1与ERK及其激活规律。实验分为常氧培养组（Non-OGD），OGD再灌注（OGD/reperfusion，OGD/R）1h、2h、6h、12h、18h、24h组共计7组。各组相应各自提取总蛋白、胞质蛋白和胞核蛋白后，进行免疫印迹法（Western blotting）检测DAPK1、磷酸化DAPK1（P-DAPK1）、磷酸化ERK（P-ERK）、磷酸化CREB（P-CREB）、磷酸化MLC（P-MLC）表达水平。 B部分探究缺血再灌注所致的神经元凋亡规律，实验操作与分组与A部分一致。各组提取总蛋白，通过Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3（Casp.3）、C-PARP表达情况。细胞免疫荧光观察Non-OGD组与OGD/R的12h、24h组细胞Casp.3表达情况并定量分析。离心收集来自Non-OGD组与OGD/R的1h、12h、24h组细胞培养基上清并进行LDH含量检测。 C部分研究DAPK1与ERK在神经元缺血再灌注所致凋亡中是否存在结合。N2a细胞Non-OGD组与再灌注24h组进行DAPK1与ERK荧光双染观察共定位，Non-OGD组与再灌注1h、24h组提取总蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）检测明确DAPK1-ERK的结合。小鼠皮质原代神经元给予溶剂处理（Non）或Gly和NMDA兴奋性毒性刺激（Gly+NMDA）后进行DAPK1与ERK荧光双染观察共定位。假手术组（Sham）以及MCAO模型再灌注0.5h、1h、2h组的雄性C57小鼠分别处死并分离大脑皮质提取总蛋白进行Co-IP检测确定DAPK1与ERK的结合。 结果：A部分结果表明，与Non-OGD组相比，OGD再灌注后DAPK1激活与ERK核转位逐渐增强，呈时间依赖性而且在再灌注24h时达到峰值。DAPK1底物P-MLC与ERK底物P-CREB对应表达增加。B部分结果表明，OGD再灌注后与Non-OGD组相比Bcl-2/Bax比值逐渐降低，凋亡效应分子Casp.3与C-PARP表达逐渐增强，细胞培养基上清LDH含量逐渐增加，再灌注所致凋亡效应在24h达到峰值。C部分结果表明，DAPK1与ERK在N2a细胞OGD试验、原代神经元兴奋性毒性与小鼠MCAO三种不同类型的缺血模型再灌注中均存在结合。 结论：神经元缺血再灌注可引发DAPK1激活、ERK核转位以及细胞凋亡的增强，并且表现为时间依赖性。OGD、兴奋性毒性与MCAO缺血模型再灌注中DAPK1与ERK均存在结合。 第二部分 下调DAPK1或抑制其活性对缺血再灌注神经元的ERK核转位及凋亡的作用 目的：研究下调DAPK1蛋白水平对常氧培养神经元凋亡有无影响，并探讨对缺氧培养神经元ERK核转位以及凋亡的作用。研究DAPK1抑制剂对神经元缺血再灌注所致凋亡的影响以及与ERK核转位的相关性。 方法：本部分实验以小鼠N2a细胞系为研究对象，OGD为缺血模型，实验分为A、B、C三部分。A部分研究下调DAPK1表达对常氧培养条件下N2a细胞凋亡的影响。分别以空载体慢病毒（empty）、无义序列对照慢病毒（scDAPK1）和DAPK1干扰慢病毒（shDAPK1）构建稳定转染细胞株。探究野生型N2a细胞（Wild type，WT）与empty、scDAPK1、shDAPK1细胞株在常氧培养条件下细胞凋亡方面是否有差异。分别提取以上4种细胞株的总蛋白进行Western blotting检测，分析DAPK1下调效应以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Casp.3和C-PARP的表达水平，流式细胞术检测各个细胞株凋亡水平。 B部分研究以上4种细胞株在OGD处理并再灌注24h之后，在细胞凋亡及ERK核转位方面的差异。各自提取不同细胞株总蛋白、胞质蛋白、胞核蛋白进行Western blotting实验，检测ERK核转位及其底物P-CREB表达，以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Casp.3和C-PARP的表达情况。细胞免疫荧光检测P-ERK在WT与shDAPK1细胞株中的胞内定位情况，分析入核率。流式细胞凋亡检测与LDH释放实验分析WT与shDAPK1细胞株在凋亡方面的差异。 C部分实验探究DAPK1高选择性抑制剂TC-DAPK6处理OGD再灌注24h的WT细胞能否抑制细胞凋亡并分析其与ERK核转位有无关联。WT细胞株进行OGD处理3h后，分别给予溶剂处理（Veh）或DAPK1竞争性抑制剂（TC-DAPK6）处理并再灌注24h，提取总蛋白、胞质蛋白、胞核蛋白进行Western blotting实验，检测ERK核转位及其底物P-CREB表达，以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Casp.3和C-PARP的表达情况。细胞免疫荧光检测P-ERK在Veh组与TC-DAPK6组中的胞内定位情况。Casp.3细胞免疫荧光与LDH释放实验分析两组在凋亡方面的差异。 结果：A部分实验结果显示常氧培养时，与WT组、empty组、scDAPK1组相比，shDAPK1组显著下调DAPK1表达且对神经元凋亡没有影响。各组之间凋亡相关蛋白表达水平以及流式细胞术凋亡分析结果无差异。B部分结果表明，OGD处理并再灌注24h后，与WT组、empty组、scDAPK1组相比，shDAPK1组ERK核转位显著增强，P-CREB表达增多，Bcl-2/Bax比例提高，凋亡效应分子Casp.3和C-PARP表达显著减少。细胞免疫荧光显示shDAPK1组与WT组相比核内P-ERK定位增多。流式细胞术和LDH释放实验显示shDAPK1组比WT组凋亡减轻。C部分结果显示，TC-DAPK6组与Veh组相比可显著抑制DAPK1活性，提高Bcl-2/Bax比例，减少凋亡效应分子Casp.3、C-PARP表达和LDH释放，但DAPK1表达与ERK核转位两组无明显差异。 结论：常氧培养时，下调DAPK1对神经元凋亡无影响。缺血再灌注时，下调DAPK1可显著增强ERK核转位并减轻神经元凋亡。TC-DAPK6抑制DAPK1活性可显著减轻缺血再灌注神经元凋亡，且该抗凋亡机制与ERK核转位无关。