论文部分内容阅读
水稻白叶枯病是由黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)引起的、严重危害水稻生产的一种细菌性病害。通过对Xoo致病相关基因的研究,使人们对Xoo致病机理以及与水稻互作的分子基础有了不少认识。然而,Xoo致病机制非常复杂,许多毒性和无毒机制目前仍不得而知,致病基因表达调控及其网络尚不清楚。前期研究已鉴定出Xoo TCS(two-component system)应答调控因子GacAxoo和鞭毛基因簇转录调控因子FleQxoo,它们参与病菌毒性和鞭毛运动性的调控。为了进一步从基因组水平上阐明GacAxoo和FleQxoo的调控作用及其机理,本研究利用基因芯片技术,比较分析了Xoo野生型菌株PXO99~A及其突变体ΔgacAxoo和ΔfleQxDD的基因转录谱,旨在发现GacAxoo和FleQxoo转录调控元(regulon),为全面揭示Xoo基因表达调控网络提供重要的信息。利用Xoo菌株KACC10331全基因组序列信息,选择出560个致病相关基因、调控因子基因、特有基因和保守基因、以及鞭毛基因簇基因,点制了一批Xoo基因芯片。对在丰富培养基(NBY)和hrp诱导培养基(XOM2)中生长到对数生长期(OD=1.2)的PXO99~A及其突变体ΔgacAxoo和ΔfleQxoo转录谱进行了比较测定。与NBY培养条件相比,PXO99~A在XOM2中培养时有17个基因发生了差异性表达,其中10个基因上调表达,7个下调表达。在10个表达上调的基因中,7个为T3SS(hrpB、hrpB1、hrpB3、hrpD6、hrpF)及其效应子(hpa1、hpaB)基因,其中hpa1上调表达最为显著,可达到13倍。Xoo hrp基因的表达显著地受到诱导型培养基XOM2培养条件的诱导。与PXO99~A相比,ΔgacAxoo在XOM2中培养时有28个基因发生了差异性表达,其中17个基因上调表达,11下调表达。在17个表达上调的基因中,1个为vieA基因,7个为假定蛋白的基因。这些基因受到GacAxoo负调控而抑制表达。在11个表达下调的基因中,1个为GGDEF家族成员基因,1个T3SS效应子基因hpa1,4个为鞭毛基因(flgC、fliC、fliO、cheA)。GacAxoo不仅调控了T3SS效应子基因hpa1的表达,而且也通过正向调控了部分鞭毛基因的表达,影响Xoo鞭毛运动性。此外,GacAxoo还可能通过正、负向调控vieA和GGDEF家族成员基因,影响第二信使c-di-GMP的代谢,从而调控了Xoo的诸多生物学性状。与PXO99~A相比,ΔfleOxoo在NBY中培养时有16个基因发生了差异性表达,其中12个基因上调表达,4个下调表达。在12个表达上调的基因中,4个为T2SS(xpsJ、xpsL、xpsN)及其效应子(egl)基因,3个为胞外降解酶(polygalacturonase,protease,cellulase S)基因,3个为鞭毛基因簇(flhA、fliK、fliO)基因,1个为GGDEF家族成员基因,1个为O抗原生物合成基因(rbfC)。这些基因的表达受到FleQxoo负调控而被抑制。4个下调表达的基因包括鞭毛蛋白基因fliE、hrpB4、果胶酯酶基因和蛋白酶基因。RT-PCR分析验证了fliE基因的表达显著地受到FleQxoo正调控。值得注意的是,fleQxoo基因自身的表达在ΔfleQxoo中非常显著,而在PXO99~A中基本不表达或表达量极低。结果表明,fleQxoo基因表达可能受到自身的抑制。总之,本研究利用基因芯片技术,通过构建Xoo及其ΔgacAxoo和ΔfleQxoo的基因转录谱,鉴别了GacAxoo和FleQxoo的部分调控元和差异性表达的基因,深入分析这些基因表达和调控的生物学信息,有助于阐明Xoo致病的分子机制。