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羧酸类代谢物几乎存在于所有的代谢通路内,以痕量水平在调控各种生理功能中起着重要作用(抗癌、炎症调控、血管收缩、抗血小板凝聚和胆固醇代谢调节等),其涉及吸烟相关的氧化应激、脂质过氧化和炎症等生物过程。因此,开发羧酸类代谢物高灵敏度和高准确性的分析方法,并在此基础上研究吸烟者与非吸烟者羧酸类代谢物的差异具有重要意义。质谱因其适用范围广、灵敏度和特异性高等特点,已成为代谢组学研究的首选方法。然而,羧酸类化合物因较低的气相质子亲和力和羧基间的氢键作用,直接应用质谱分析是相对困难的。此外,在非目标性分析及部分内标物获取困难的目标性分析中,质谱的信号容易波动,同时复杂生物样本的基质对目标物抑制明显。因此,利用质谱分析羧酸类化合物时存在灵敏度低、定量不准确和结果重复性差等问题。 近年来,最早应用于蛋白组学相对定量研究中的稳定同位素标记(SIL)技术扩展到代谢组学领域中。SIL通过化学衍生化向目标物中引入稳定同位素标签和信号增敏基团,再借助于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对差异标记样品的信号识别,可以提高质谱检测时目标物的离子化效率和灵敏度,实现次级代谢组学分析,并且允许具有相同官能团的一类分析物同时获得相应的同位素内标化合物。因此,本文利用SIL结合质谱不同扫描模式的方法,对血浆羧酸类代谢物进行非目标性足性分析与目标性定量分析,从而实现对吸烟者与非吸烟者血浆羧酸类差异代谢物的研究。研究内容主要包括以下两个部分: 一、利用一对SIL试剂Ⅳ,Ⅳ-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N, N-二甲基乙二胺(d4-DMED),建立了稳定同位素标记结合液相色谱-双中性丢失扫描-质谱方法(SIL-LC-DNLS-MS)用于血浆羧酸类代谢物的非目标性定性分析,以及稳定同位素标记结合液相色谱-预设定多反应监测-质谱方法(SIL-LC-sMRM-MS)用于血浆羧酸类代谢物的相对定量分析。以7种结构不同的羧酸为模型化合物,建立了稳定同位素标记-液相色谱串联质谱(SIL-LC-MS/MS)方法,用以优化同位素标记试剂对羧酸类化合物的衍生化条件。在最优的衍生化条件下对衍生化效率、灵敏度变化、稳定性、衍生物质谱裂解行为和血浆羧酸类代谢物的提取效率等方面进行评价。结果表明,一元羧酸的标记效率大于96.3%,二元羧酸的标记效率相对较低为83.4%,7种羧酸类化合物经DMED标记后检测灵敏度提高了63-322倍;衍生物稳定且DMED和d4-DMED衍生物具有相同的质谱裂解行为;乙酸乙酯提取血浆羧酸类代谢物的提取回收率为94%~110%。对衍生化条件优化所使用的SIL-LC-MS/MS方法进行验证,该方法的线性关系良好,相关系数在0.9955~0.9992之间,检测限和定量限分别为0.09~80 ng/L和0.3~250 ng/L,准确度为92.9%~116.7%,日内精密度和日间精密度分别小于12.8%和15.1%。 二、将建立的SIL-LC-DNLS-MS和SIL-LC-sMRM-MS方法相结合,应用于吸烟者与非吸烟者血浆羧酸类差异代谢物的研究中。通过DNLS模式监测DMED和d4-DMED标记的羧酸类代谢物分别裂解产生与母离子结构无关的特征中性片段45 Da和49 Da,在人类血浆中共发现269个潜在的羧酸类代谢物。随后建立SIL-LC-sMRM-MS方法对35名吸烟者与35名非吸烟者血浆羧酸类代谢物进行相对定量分析。在该sMRM方法中,[M+H]+→[M+H-45]+和[M+4+H]+→[M+H-49]+分别作为DMED和d4-DMED标记的羧酸类代谢物的离子对。利用质量控制样品(QC)对相对定量方法进行验证,QC在主成分分析得分图中聚集在一起,并且84%和98%的羧酸类代谢物的相对标准偏差分别在10%和20%以内,表明分析平台稳定性好、数据可靠并且方法具有良好的精密度。对相对定量数据进行单/多变量统计分析,在吸烟者与非吸烟者血浆中发现88个具有显著性差异的潜在的羧酸类代谢物。购买市售的差异代谢物的标准品,通过标准品比对,目前已确认7,10-顺十六碳二烯酸、肉豆蔻酸和3-羟基-5-胆甾烯酸为吸烟者与非吸烟者血浆中的差异代谢物。7,10-顺十六碳二烯酸是具有抗炎、抗氧化和抗动脉粥样硬化等特性的共轭亚油酸的代谢物;肉豆蔻酸参与能量代谢、碳水化合物和脂质代谢等通路;3-羟基-5-胆甾烯酸参与初级胆汁酸的生物合成。吸烟者血浆中7,10-顺十六碳二烯酸水平显著低于非吸烟者,肉豆蔻酸和3-羟基-5-胆甾烯酸水平显著高于非吸烟者,表明吸烟影响炎症介质的表达,同时引起胆汁酸合成和胆固醇代谢异常。