中药现代化研究证明,不管是复方中药还是单味中药,基本上是以多种化学成分通过不同途径作用于不同的生物大分子靶点,最终体现为整体调节的功效。在具体的药理学研究中往往关注某一成分的作用,而忽视多个成分对生物大分子的相互作用,如多个成分对代谢途径关键酶的作用。我们通过研究复合抑制剂对酪氨酸酶的相互作用,探讨复合抑制剂的相互作用机理,也可为复合抑制剂在美白功效方面的应用提供理论依据。酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)是人体及动植物酪氨酸代谢的关键酶。酪氨酸酶的代谢产物黑色素决定着人体皮肤颜色深浅,另外,酪氨酸酶也是果蔬氧化褐变及昆虫蜕皮生化反应过程的关键酶。目前对于酪氨酸酶活性的抑制作用机理的研究主要集中在单一抑制剂抑制作用,在实际应用中也主要是添加酪氨酸酶抑制剂,多种酪氨酸酶抑制剂复合的应用较少。为了达到最佳的酪氨酸酶抑制效果,研究者开始尝试复合使用多种酪氨酸酶抑制剂,但多种抑制剂间的相互作用不一定是人们所期望的协同效应,也可能是简单相加作用甚至是拮抗效应,因此开展复合酪氨酸酶抑制剂作用机理及应用研究在化妆品、医药、食品保鲜等方面具有重要的的现实意义。壬二酸,4-己基间苯二酚是目前化妆品中常用的酪氨酸酶抑制剂的美白添加成分,肉桂酸具有防腐抗菌作用,也是潜在的化妆品添加剂,常常与美白成分合用。本文以壬二酸、肉桂酸和4-己基间苯二酚这三种抑制剂为代表,开展复合抑制剂对酪氨酸酶活性抑制的相互作用研究,壬二酸又叫杜鹃花酸,天然存在于杜鹃花、当归、党参、黄蒿、木槿皮、白桦树中。肉桂酸,又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸,是从肉桂皮或安息香分离出的有机酸。壬二酸,4-己基间苯二酚是目前化妆品中常用的酪氨酸酶抑制剂的美白添加成分,肉桂酸具有防腐抗菌作用,也具有美白功效。三种成分及相互间合用对酪氨酸酶作用的研究内容和结果如下:分别研究了壬二酸、肉桂酸和4-己基间苯二酚这三种抑制剂单独及复合使用时对酪氨酸酶的抑制效果。Lineweaver-Burk图形分析表明,壬二酸和4-己基间苯二酚属于竞争性抑制剂,肉桂酸属于非竞争性抑制剂。两种竞争性抑制剂复合(壬二酸和4-己基间苯二酚)的Lineweaver-Burk直线与单一竞争性抑制剂的图形类似,都交于纵轴上的同一点;而非竞争性抑制剂与竞争性抑制剂复合(肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基间苯二酚)得到的一簇直线相交于第二象限的不同坐标点。同时测定了壬二酸、4-己基间苯二酚和肉桂酸单独及两两复合对酪氨酸酶活性的半抑制率浓度IC50,结果显示三种抑制剂对酪氨酸酶抑制作用具有浓度依赖性,壬二酸、肉桂酸、4-己基间苯二酚的半抑制率浓度(IC50)分别为,8.61mmol/L、0.953mmol/L、1.70μmol/L,抑制作用最强的是4-己基间苯二酚,其次为肉桂酸,三者中最弱的是壬二酸。利用效应物复合作用的等效线法和中效原理法评价了两种抑制剂复合使用时抑制酶活性的相互作用效果,结果表明肉桂酸、壬二酸、4-己基间苯二酚两两复合可产生相互协同增效的酶活性抑制效应。小鼠B16黑色素瘤细胞培养应用于黑色素生成抑制剂的筛选以及细胞毒性的研究,为黑色素生成抑制剂的筛选提供了一种快捷途径,有望发展成为高通量筛选方法。实验研究了三种抑制剂单独及复合情况下对小鼠B16黑素瘤细胞抑制效果及对酪氨酸酶活力的影响,采用CDI和Q值方法评价,发现在实验中所采用的抑制剂浓度下进行复合,抑制剂间存在相互作用,但不同的评价方法得出的相互作用效应的结论可能不一致。以灰度为指标分别探讨了壬二酸、肉桂酸、4-己基间苯二酚在抑制山药切片褐变中的效果,实验结果说明三种酪氨酸酶抑制剂都具有一定程度的抑制山药切片褐变的作用,抑制剂复合使用比单独使用抑制褐变效果增加,但未见明显的协同增效作用。分别研究了通过荧光光谱法研究分析酶与抑制剂结合后的荧光光谱变化。结果表明,壬二酸和肉桂酸的Stern-Volmer曲线图均有明显的线性关系,变温实验结果显示肉桂酸对酪氨酸酶的荧光猝灭作用表现为静态猝灭作用,壬二酸的猝灭作用为动态猝灭。肉桂酸与酪氨酸酶的结合能力大于壬二酸,这可能是肉桂酸对酪氨酸酶活性抑制强于壬二酸的原因之一。在壬二酸存在的条件下,肉桂酸对酪氨酸酶荧光猝灭作用有较明显的改变,结合常数和结合位点均明显增大,显示壬二酸对肉桂酸与酪氨酸酶的结合具有促进作用。