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生物表面活性剂因具有高表面活性、安全无毒、可生物降解等特点,而被广泛应用于石油开采、污染环境修复等领域。目前所获得表面活性剂产生菌绝大多数为好氧微生物,但是在某些缺氧环境中的应用,如油藏原位产表面活性剂驱油以及河流底泥的原位污染修复等,需要厌氧产表面活性剂的菌种资源。本论文针对厌氧产表面活性剂菌种资源匮乏,化学驱油技术产生的污水处理成本高、难度大等问题;立足于开发基于厌氧产鼠李糖脂菌株的环保型采油技术的需要;筛选厌氧产鼠李糖脂表面活性剂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株,对其进行培养基优化和基因改造,强化其厌氧产鼠李糖脂的能力,并解析厌氧产鼠李糖脂菌株的驱油机制,评价其应用潜力。研究成果对具有厌氧产表面活性剂能力的微生物菌剂的开发和油田环保型采油技术的发展具有重要理论指导意义。本论文从油藏采出液中筛选出了一株在好氧及厌氧条件下均能产鼠李糖脂的菌株SG,好氧产量为8237.5mg/L,厌氧产量为222.6mg/L。结合形态学描述及16S rDNA序列(GenBank序列号为KJ995745)分析,将菌株SG鉴定为Pseudomonas aeruginosa SG。菌株SG厌氧产鼠李糖脂的适宜条件为温度30℃~40℃、pH值6.0~7.5、Na Cl浓度低于30g/L。在厌氧条件下,菌株SG经34h进入菌体生长的稳定期,鼠李糖脂产量在192h时达到最高。本论文还建立了快速而准确定量发酵液中鼠李糖脂含量的排油圈法,排油圈直径(mm)与鼠李糖脂浓度(100~800mg/L)呈极显著的线性回归关系(P<0.001)。菌体细胞和发酵液中的其他代谢产物对排油圈法的定量结果没有影响。菌株SG厌氧产鼠李糖脂的最佳碳源是甘油、最佳氮源是硝酸盐,限制氮源和磷源的量均不利于菌株厌氧生产鼠李糖脂。响应面法优化后的培养基配方(g/L)为:甘油70.32,NaNO3 4.87,K2HPO4·3H2O 6.97,KH2PO4 5.49,MgSO4·7H2O 0.40,CaCl2 0.13,KCl 1.0,NaCl 1.0。利用该培养基,菌株SG在厌氧条件下的鼠李糖脂的产量提高到了683.4mg/L。利用分子生物学技术,以肽聚糖相关脂蛋白编码基因oprL的组成型强启动子PoprL替换rhlAB基因的原始启动子,构建了融合基因Popr-rhlAB拷贝数增加的基因工程菌Pseudomonas aeruginosa PoprAB;强化了菌株厌氧产鼠李糖脂的能力,实现了对厌氧产鼠李糖脂菌株的基因改造。利用优化后的培养基,基因工程菌PoprAB在厌氧条件下的鼠李糖脂产量达到1094.6mg/L,比菌株SG在厌氧条件下的产量提高了60.2%。菌株SG在好氧条件下的鼠李糖脂产物的临界胶束浓度为60mg/L,而在厌氧条件下的鼠李糖产物的临界胶束浓度为80mg/L。菌株SG的厌氧鼠李糖脂产物对原油具有更好的乳化活性,EI24值为80.33%,高于其好氧鼠李糖脂产物的62.30%。HPLC-MS分析结果表明,菌株SG的好氧鼠李糖脂产物包含54.76%的单鼠李糖脂和45.24%的双鼠李糖脂;而厌氧鼠李糖脂产物包含95.69%的单鼠李糖脂和4.31%的双鼠李糖脂。菌株SG在好氧和厌氧条件下的鼠李糖脂产物组成的不同导致了两种条件下鼠李糖脂产物的活性差异。通过油藏模拟实验,阐明了厌氧产鼠李糖脂菌株的驱油机制,并验证了其油藏原位驱油潜力。厌氧产鼠李糖脂菌株SG和PoprAB均可以在模拟油藏条件下稳定地生长繁殖,并生产鼠李糖脂。厌氧高产鼠李糖脂的基因工程菌PoprAB的添加使得模拟油藏体系中的微生物群落结构先发生变化、后又恢复到接近初始的状态,在培养期间假单胞菌属一直是体系中的优势菌属之一。岩心物理模拟驱油实验显示,在一次水驱的基础上,野生型菌株SG和基因工程菌PoprAB可分别提高原油采收率7.26%和9.15%。上述结果验证了利用厌氧产鼠李糖脂菌株在油藏原位产鼠李糖脂表面活性剂进行驱油的应用潜力和可行性。本论文获得的厌氧产鼠李糖脂菌株为油藏原位产表面活性剂驱油的新型微生物采油技术提供了菌种资源。