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目的1研究ALA-PDT在体外对宫颈癌细胞的生长抑制作用特点,以寻找对ALA-PDT最敏感的宫颈癌细胞株和影响细胞增殖的最佳作用参数。2探讨ALA-PDT对宫颈癌细胞的生长抑制机制,为深入探讨光动力作用杀伤宫颈癌细胞的生物学机制提供理论依据。3分析ALA-PDT对宫颈癌裸鼠移植瘤的体内疗效,对不同给药途径的PDT治疗效果比较,以寻找光毒反应最小的给药方式。4结合体外和体内实验,探讨ALA-PDT诱导宫颈癌细胞凋亡的作用途径。方法1 MTT法检测ALA-PDT对宫颈癌细胞增殖的影响,并筛选ALA-PDT对宫颈癌细胞增殖影响的最佳作用参数。2通过直接观察细胞形态、May-Grunwald Giemsa染色、Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞凋亡、Hoechst 33342荧光染色结合荧光显微镜观察ALA-PDT对宫颈癌细胞凋亡的影响、流式细胞仪分析ALA-PDT后细胞周期变化、Western blot检测ALA-PDT对宫颈癌细胞Survivin蛋白表达的影响、相对实时荧光定量PCR法检测ALA-PDT对宫颈癌细胞RNA的影响,以明确ALA-PDT对宫颈癌细胞的生长抑制机制。3选择对ALA-PDT最敏感人宫颈癌Me180细胞系建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型,通过人宫颈癌裸鼠移植瘤体内抑瘤实验、苏木精-伊红（HE）常规染色、免疫组化法检测ALA-PDT对宫颈癌肿瘤组织Survivin和VEGF蛋白表达的影响等方法,对局部给药和尾静脉给药两种给药方法进行比较研究。4相对实时荧光定量法检测ALA-PDT对宫颈癌肿瘤组织mRNA的影响,结合体外实验结果探讨ALA-PDT对宫颈癌细胞的生长抑制机制和作用途径。结果1 MTT结果表明,ALA-PDT在体外对宫颈癌细胞均有生长抑制作用,其中宫颈癌Me180细胞株是8种肿瘤细胞株中对ALA-PDT最敏感的细胞株,其IC50为6-7×10-4M。单独使用10 mM以下的ALA对宫颈癌细胞没有明显的毒性反应,10—30 J/cm2的激光剂量对宫颈癌细胞也没有明显的毒性。照射后4 h为ALA-PDT作用后的最佳时间。2 Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测结果表明:ALA-PDT可以显著的诱导Me180细胞凋亡,作用后3h的凋亡主要表现为早期凋亡,到24h的时候,早期凋亡率降低,晚期凋亡率增高,总凋亡率降低,考虑为凋亡的时相问题。ALA-PDT作用后3h,1mM和2mM的ALA-PDT组的总凋亡率增高非常显著,高达52.45%和77.92%。3直接观察细胞形态、May-Grunwald和Giemsa染色、Hoechst 33342荧光染色结合荧光显微镜均观察到细胞的凋亡现象。4周期分析结果表明,ALA-PDT作用后4h,Me180细胞的周期分布无明显改变;ALA-PDT作用后24h,宫颈癌细胞Me180的周期分布出现了明显的改变,1 nM～2 nM的ALA-PDT均有显著的G0-G1期阻滞的作用,S和G2/M期明显减少。5相对实时荧光定量法检测不同组别的凋亡相关基因Survivin、P53、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表达水平。证明PDT治疗后凋亡抑制基因Survivin和Bcl-2的mRNA的表达明显降低（P＜0.001）,而促凋亡基因P53、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表达水平稍有增高（P＞0.05）。6 Western blot检测结果表明,ALA-PDT可显著的抑制Me180细胞的Survivin蛋白表达,0.1mM、1mM、2mM的抑制率分别为48.42%、71.22%、73.84%。7 ALA-PDT对宫颈癌Me180细胞移植瘤生长的影响:治疗后瘤体早期出现发红、出血,24小时后肿瘤表面和切面出现局部坏死和变黑。静脉给药PDT组和局部给药PDT组的肿瘤体积与对照组相比明显减小,差异有显著意义（P＜0.001）,其中局部给药PDT组在7-14天时体积最小,且体积减小最明显。8 HE常规染色可观察到:对照组、单纯静脉给药组、单纯局部给药组、单纯激光照射组无明显变化,而静脉给药PDT组和局部给药PDT组肿瘤受激光照射的皮下细胞区域坏死明显。9免疫组化蛋白检测结果表明,ALA-PDT可显著的抑制宫颈移植瘤组织的Survivin和VEGF的蛋白表达。10移植瘤组织mRNA的相对实时荧光定量结果证明PDT治疗后凋亡抑制基因Survivin和Bcl-2的mRNA的表达明显降低（P＜0.001）,而促凋亡基因P53、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表达水平稍有增高,但差异无统计学意义。与体外实验结果基本一致。结论1 ALA-PDT在体外对宫颈癌细胞有明显的生长抑制作用,在,一定浓度范围内均呈现剂量-效应关系。宫颈癌Me180细胞株是8种肿瘤细胞株中对ALA-PDT最敏感的细胞株。2早期诱导宫颈癌细胞株Me180细胞发生凋亡是ALA-光动力抑制作用的重要机制之一。3线粒体依赖性途径在ALA-PDT诱导宫颈癌细胞株Me180细胞发生凋亡机制中起重要作用。4结合体内和体外实验,ALA-PDT对宫颈癌治疗是有效的。5临床用光动力治疗宫颈癌或癌前病变患者应尽量使用局部给药方式,以减少PDT光毒作用的危害和不便。