论文部分内容阅读
蛙类养殖业可以满足人类食用、药用等需求,但是,一些疾病的爆发常使得蛙类养殖户遭受巨大的损失。当蛙类在养殖过程中爆发疾病的时候,常见多为细菌性疾病,传统的研究方法一般是,首先调查病原体,从病蛙的体内分离并纯化得到细菌,然后通过一系列生理生化和分子手段去鉴定细菌,接着通过回归感染实验验证病原菌,最后通过药敏试验,提出治疗药物的选择建议。这一过程,往往周期比较长,并且此时许多蛙患病程度已经很严重。本研究从致病菌的角度入手,以最常见的气单胞菌属(Aeromonas)蛙类致病菌(嗜水气单孢菌(A.hydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、维氏气单胞菌(A.veronii))作为研究重点,利用环境DNA技术和多重PCR,建立蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术,并试图从属的水平上提供用药参考,以期为蛙类细菌性疾病早期防治工作提供新思路及理论基础。本文的主要研究结果如下:1、建立了一种提取水体环境DNA的方法。采用滤膜法和沉淀法对两个不同大小的水域进行环境DNA提取,并比较了所得环境DNA的产量和质量,以此建立了一种高效实用的水环境DNA提取方法,可以适用于条件不同的水体。2、通过比较4种气单胞菌属常见致病菌及其他14个非气单胞菌的蛙类致病菌属16S rDNA序列,筛选出了2对可以用于气单胞菌属蛙类常见致病菌PCR扩增的特异性引物,PCR扩增产物大小分别为229bp和688bp,并且还可以结合环境DNA技术对水体进行气单孢菌属蛙类常见致病菌检测。3、通过比较嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌这4种气单胞菌属常见致病菌gyrB基因序列,设计筛选出4对可以用于鉴定这4种气单胞菌的特异性引物,其中,用于鉴定嗜水气单孢菌的引物PCR扩增产物大小为266bp;用于鉴定温和气单胞菌的引物PCR扩增产物大小为99bp;用于鉴定豚鼠气单胞菌的引物PCR扩增产物大小为518bp;用于鉴定维氏气单胞菌的引物PCR产物大小为120bp。并利用多重PCR技术,建立了嗜水气单孢菌/维氏气单胞菌的双重PCR以及温和气单胞菌/豚鼠气单胞菌的双重PCR,可以用于这四种气单胞菌快速检测。4、根据文献筛选出的10种抗菌药物,由此对嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌这4种气单胞菌属常见致病菌进行药敏试验。结果发现这10种抗菌药物的对气单胞菌属蛙类常见致病菌的抑菌效果都很好。