研究背景:恶性肿瘤在常规治疗后的复发率极高,难以从患者身上根除。就其治疗而言,经典的方法仍然是根治性病灶切除术联合放化疗,但这些手段常不能彻底去除残留或转移的肿瘤细胞,达到理想的根治效果。目前,免疫治疗正在逐步成为一种具有广阔前景的辅助性手段。近年来,肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）逐渐成为肿瘤免疫治疗的研究热点。TME与机体正常组织器官的局部生理环境在细胞及细胞因子构成,营养物质代谢,组织供氧,p H值及氧化性等方面存在较大差异。肿瘤细胞与肿瘤微环境之间互为因果,共存共生。TME中免疫细胞的分化和功能出现了不同程度的缺陷,这也导致了TME的复杂和多变性。大量的研究表明肿瘤微环境对促进肿瘤血管生成、诱导耐药和协助转移等方面有着重要影响。因此,肿瘤免疫治疗除了辅助常规治疗外,还应具有持久的免疫监测作用,通过重塑肿瘤微环境,以避免肿瘤复发。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage,TAM）是最丰富的肿瘤组织浸润性白细胞之一。TAM在肿瘤微环境中主要表现为抗肿瘤的M1亚型和促肿瘤的M2亚型。M1型细胞抗原提呈能力强,并能分泌TNF-α、IL-12、IL-23等促炎细胞因子。相反,M2型细胞具有较强的抗炎活性,可以释放IL-4、IL-10和IL-13等,抑制T细胞活性。因此,理想的免疫治疗策略是增加TME中M1细胞亚型,减少M2细胞亚型,以重塑肿瘤微环境,增强抗肿瘤免疫。集落刺激因子I受体（Colony stimulating factor 1 receptor,CSF-1R）属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族。CSF-1R及其配体CSF-1的过表达广泛存在于各类实体肿瘤中,在恶性肿瘤的增殖、转移和微环境的调控等方面起着促进作用。CSF-1R信号通路对巨噬细胞的分化与存活十分重要,常通过诱导TAMs的分化达到免疫抑制作用。BLZ-945是一种高选择性CSF-1R抑制剂,可有效抑制CSF-1R活性,减少TAMs或改变其表型,促进CD8+T细胞浸润,最终抑制肿瘤生长。但由于BLZ-945存在肿瘤靶向效率低、生物药效差、不良反应多等缺点,如何提高其在靶点位置的有效蓄积,减少不良反应并增加治疗收益则有待进一步研究。纳米药物递送系统（Nano drug-delivery system,NDDS）已被证明在恶性肿瘤的治疗中具有显著优势,而构建肿瘤微环境敏感性药物递送系统对于制剂的有效性和安全性都非常重要。研究表明葡聚糖能与M2巨噬细胞的CD206受体特异性结合,但CD206受体在体内分布广泛,尤其是肝脏组织。这使得以葡聚糖为基础的靶向药物在机体非特异性分布,经过体液循环后,常在肝脏中大量蓄积并被代谢清除。以细胞膜为基础的药物递送系统优势性显著,与传统的药物载体相比,其具有长循环、低免疫原性、良好的生物相容性等特点。而红细胞-肿瘤细胞杂化膜能更好的兼顾免疫逃逸和同源靶向性,具有更广阔的应用前景。药物的有效释放能直接影响抗肿瘤效果,因此载体到达肿瘤靶点后,如何顺利突破细胞膜并充分释放药物,则是另一个需要解决的问题。基于上述情况,我们联想到肿瘤微环境的特殊性,即弱酸性的特点。因为肿瘤细胞生长迅速,而异常的脉管系统无法满足其高代谢的氧需求。长期的乏氧状态使肿瘤细胞进行无氧糖酵解并产生乳酸;而异常的脉管系统亦不能将代谢物乳酸有效运输;同时由于质子泵加速酸性物质向细胞外转运,致使肿瘤组织p H值低于正常。基于肿瘤微环境特点设计的p H响应型纳米药物递送系统,能够在正常生理状态下保持稳定的结构,而在肿瘤微环境低p H条件下响应性地释放药物,进而增强肿瘤部位的药物递送效率。综上,本课题设计并构建了针对肿瘤微环境中TAMs的p H响应型红细胞-肿瘤细胞杂化膜包覆的聚合物胶束。通过红细胞-肿瘤细胞膜介导的主动靶向与“EPR效应”介导的被动靶向相结合,利用肿瘤组织局部弱酸性的p H变化及“质子海绵效应”使药物BLZ-945在靶细胞准确、快速、高效地释放,有效提高了药物制剂的生物利用度,进而重塑肿瘤免疫微环境,达到抗肿瘤疗效。研究目的:本课题将免疫学、材料学、药剂学、分子生物学等多学科交叉,并与药物免疫治疗技术、纳米技术相综合,优势互补,拟针对TAMs构建红细胞-肿瘤细胞杂化膜包覆的仿生纳米药物递送系统。以体外细胞学、体内动物模型为研究方法,从细胞毒性、细胞摄取、组织分布、生物安全性、抗肿瘤效果、免疫学指标等方面综合评价红细胞-肿瘤细胞杂化膜包覆的胶束复合物。本研究为构建针对肿瘤微环境的特异性靶向药物递送系统探索可行性方案;为临床抗肿瘤药物提供高效、低毒的载体;为重塑肿瘤微环境的免疫治疗开拓新的方向。第一部分杂化膜包覆胶束复合物的制备及表征研究方法:采用共挤出法制备红细胞-肿瘤细胞杂化膜包覆的p H敏感型TAM靶向共聚物胶束。首先合成葡聚糖-g-聚组氨酸共聚物（Dextran-grafted-poly（histidine）copolymer,DH）,并通过疏水作用力将BLZ-945包载于胶束疏水内核中,最后在DH表面包覆红细胞-肿瘤细胞杂化膜（Erythrocyte-cancer cell hybrid membrane,ECm）,制备成载药DH@ECm。通过核磁共振氢谱法（1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR）对DH的结构进行表征;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳法（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）对细胞膜包覆效果进行表征;采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）测定DH和DH@ECm的包封率;采用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）对载药DH和DH@ECm进行形态学观察和对比;利用动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）对各组载药制剂在不同p H条件下的粒径和Zeta电位进行表征;利用透析法考察各组载药制剂在不同p H条件下的体外释药行为。研究结果:1H-NMR表征显示DH成功合成,SDS-PAGE表明杂化膜成功包覆在载药DH的表面。DH和DH@ECm的包封率分别为82.1%和81.5%。TEM显示载药DH和DH@ECm均为尺寸均一、形状规则的球状粒子,并且能在DH表面清楚的观察到“核-壳”结构。空白的DH、包载BLZ-945的DH和包载BLZ-945的DH@ECm,粒径分别为163.4 nm、172.1 nm和194.3 nm,且各组制剂的Zeta电位均约为-20 m V。载药DH和DH@ECm在p H 6.5条件下的累计释放度在65%以上,体外释放行为相似,呈现一定的p H依赖性。研究结论:1.本章节成功合成了介质共聚物DH,并提取了红细胞及肿瘤细胞膜;成功地制备了药物载体DH@ECm,并对其进行了系统的制剂学表征。2.所制备的药物载体DH@ECm在肿瘤酸性微环境中可快速释放药物,分析原因可能是由于其发生潜在的“膜逃逸效应”,需在后续实验中进一步验证。3.该实验结果为后续体外细胞实验和体内动物实验奠定基础。第二部分杂化膜包覆胶束复合物的体外细胞学研究研究方法:本章在细胞层面对胶束复合物的体外细胞毒性、细胞摄取及其对靶细胞相关指标的影响进行了考察。以4T1细胞和M2型巨噬细胞作为研究对象,采用噻唑蓝（Thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）比色法考察各制剂组在不同p H条件下对两种细胞的细胞毒性。通过激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）和流式细胞术（Flow cytometry,FCM）分别定性和定量地考察了不同p H条件下不同制剂组中M2型巨噬细胞的摄取行为,并验证葡聚糖介导的主动靶向作用。构建TAMs的M1和M2亚型,利用共培养技术分析不同p H条件下制剂的靶向性。通过免疫蛋白质印迹法（Western blot,WB）测定不同制剂在不同p H条件下对CSF-1R的磷酸化水平（Phospho-colony stimulating factor 1receptor,p CSF-1R）,进而评估对CSF-1R的抑制能力。采用细胞共培养技术分析和测定不同制剂组对4T1和M2型巨噬细胞的作用。研究结果:MTT结果显示,空白DH@ECm载体作用于两种细胞后的细胞存活率均高于80%,表明复合物胶束载体的细胞毒性较低。采用WB法测定M2型巨噬细胞中p CSF-1R含量,结果表明:在p H 7.4条件下,BLZ-945对CSF-1R存在显著抑制作用,DH组对CSF-1R的抑制作用高于单独给药BLZ-945组,DH组对CSF-1R的抑制作用高于DH@ECm组;在PH 6.5条件下,DH组与DH@ECm组对CSF-1R的抑制作用无明显差异;DH@ECm组,在PH 6.5条件下对CSF-1R的抑制作用显著高于PH 7.4条件。此结果与本章的体外细胞摄取和细胞毒性实验结果相一致。M1和M2型共培养的细胞摄取结果还表明,DH具有靶向M2型巨噬细胞的能力,DH@ECm在酸性环境中具有靶向M2型巨噬细胞的能力。4T1和M2型细胞共培养结果显示,制剂组对于M2型巨噬细胞有明显的耗竭作用,然而对于4T1细胞没有显著的凋亡诱导现象。研究结论:1.DH@ECm没有明显的细胞毒作用,具有良好的安全性及生物相容性。2.在酸性环境中,DH@ECm具有p H响应特性和独特的“膜逃逸效应”。3.葡聚糖残基能促进制剂被TAMs识别和内化,并耗竭TAMs,具有M2型靶向性。4.包载BLZ-945的DH@ECm仅对TAMs有耗竭作用,对肿瘤细胞无作用。5.DH@ECm在肿瘤免疫治疗中具有一定应用前景。第三部分杂化膜包覆胶束复合物体内抗肿瘤药效学研究及免疫学评价研究方法:以荷瘤小鼠为研究对象,利用亲脂性细胞膜绿色荧光探针（Di O）,结合小动物活体成像技术,考察了Di O标记的各胶束复合物在荷瘤小鼠体内的循环情况、组织器官分布情况和代谢清除情况,评价其体内肿瘤组织靶向蓄积能力。利用免疫荧光技术（Immunofluorescence technique,IFT）对离体切片进行染色等处理,综合瘤体变化、抑瘤率、存活率等指标,重点进行了胶束复合物在体内抗肿瘤药效学研究。酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组肿瘤组织中细胞因子的表达水平。在C57BL/6小鼠体内对胶束复合物进行安全性评价,以小鼠体重和苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,H&E）的主要组织石蜡切片损害程度的形态学改变为考察指标,评估了DH和DH@ECm两种制剂的体内生物安全性。研究结果:活体成像结果显示,随着循环时间延长,与Di O溶液相比,Di O标记的胶束复合物均表现出良好的肿瘤组织靶向能力,其中DH@ECm组的肿瘤组织荧光强度最强,表现出显著的长循环效果和肿瘤靶向性。药效学结果显示,与游离的BLZ-945组相比,DH@ECm组能明显地抑制肿瘤生长,是由于DH@ECm具有p H响应性,能够在肿瘤酸性微环境中快速发挥“膜逃逸”作用以增加TAMs靶向性,同时特异性释放BLZ-945达到高效耗竭TAMs。瘤体变化、抑瘤率、存活率等指标均表明DH@ECm组在荷瘤小鼠体内具有良好的抗肿瘤药效。免疫荧光实验表明,DH@ECm组能增加CD8+T细胞浸润,激活抗肿瘤免疫。ELISA检测表明DH@ECm显著提高了IL-12p70的表达;降低了IL-10、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9,MMP-9）、肿瘤组织血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,逆转了免疫抑制性肿瘤微环境。对制剂组进行安全性研究显示,两组胶束复合物无明显的脏器毒性,小鼠耐受性良好。研究结论:1.DH@ECm可高效靶向肿瘤组织,靶向TAMs,降低药物在机体正常组织的分布。2.DH@ECm能够协助BLZ-945,充分发挥抗肿瘤活性及药效。3.包载BLZ-945的DH@ECm可有效重塑肿瘤免疫抑制微环境,激活抗肿瘤免疫应答,抑制肿瘤生长。4.包载BLZ-945的DH@ECm没有对机体造成显著的非特异性损伤,是安全有效的药物递送系统。结论:1.本研究制备了一种包载BLZ-945的红细胞-肿瘤细胞杂化膜伪装的p H响应型共聚物胶束（DH@ECm）,通过靶向并耗竭TAMs,重塑肿瘤免疫微环境,以达到对恶性实体瘤的免疫治疗。2.此仿生纳米药物载体具有良好的生物相容性,低细胞毒性以及体内长循环的特性。3.在肿瘤免疫微环境中,包载BLZ-945的DH@ECm可通过靶向M2型巨噬细胞耗竭TAMs,同时引起CD8+T细胞浸润,激活抗肿瘤免疫应答,实现免疫治疗。4.本研究为实体瘤的靶向免疫治疗提供了新的思路。