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酚氧化酶(phenoloxidase,简称PO, EC.1.14.18.1)在昆虫的生理发育和内源性免疫过程中具有重要功能,如黑化或包被入侵的病原物、昆虫伤口的愈合等。目前对酚氧化酶酶原(proPO)的激活途径进行了很多研究,但对激活的整个过程和机制仍不太清楚；有研究表明鳞翅目昆虫的proPO主要产生于血淋巴的类绛色细胞,但其进化和形成过程尚不十分明确。为了进一步研究昆虫proPO的性质与功能,探讨其在昆虫生长发育过程中的作用,本文采用鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostella)和菜青虫(Pieris rapae)为研究对象,采用RT-PCR技术克隆得到了编码小菜蛾PxPPO1和PxPPO2基因的全长编码区序列,并将该片段与表达载体pET-30a连接构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得融合蛋白。另外,本文采用球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的成熟孢子侵染菜青虫4龄幼虫,并通过实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)分析了侵染不同时间后PPO1在菜青虫体内的表达情况；收集不同发育时期菜青虫血淋巴,统计其类绛色细胞的数量,研究不同发育时期类绛色细胞密度与PrPPO1表达量之间的关系。主要内容如下：1.将克隆到的PxPPO1的ORF片段插入到pET-30a原核表达载体中,构建了长度为7451bp的重组质粒PET-30a-PxPPO1,在大肠杆菌系统中诱导表达,得到83kDa(PxPPO178.56kDa, His-tag4.66kDa)的目标蛋白,该目标蛋白的表达量占总细胞的50%以上,超声破碎后分析,常规条件下诱导表达的蛋白以包涵体的形式存在。2.将克隆得到的PxPPO2的ORF片段插入到pET-30a原核表达载体中,构建了长度为7480bp的重组质粒pET-30a-PxPPO2,在大肠杆菌系统中诱导表达,得到84.5kDa (PxPPO279.86kDa, His-tag4.66kDa)的目标蛋白,该目标蛋白的表达量占总细胞的50%以上,超声破碎后分析,常规条件下诱导表达的蛋白以包涵体的形式存在。3.优化诱导表达条件的结果表明,PxPPO1经不同浓度的IPTG诱导产生融合蛋白的表达量均占细菌总蛋白表达量的60%以上,不同浓度对蛋白表达量的影响不明显；PxPPO1在同样条件下诱导不同时间,3h后,融合蛋白的表达量占细菌总蛋白表达量的32%,8h后,达到总蛋白的62%；不同温度下诱导PxPPO1,30℃融合蛋白有较高的表达,约占细菌总蛋白表达量的84%；在15℃诱导该比例达到73%。4. PxPPO2经不同浓度的IPTG诱导产生融合蛋白的表达量均占细菌总蛋白表达量的62%以上,不同浓度对蛋白表达量的影响不明显；PxPPO2在同样条件下诱导不同时间,3h后,融合蛋白的表达量仅占细菌总蛋白表达量的27%；6h后,所占比例明显上升,达到40%,诱导8h后,达到58%；不同温度下诱导PxPP02,在15℃、20℃、25℃和30℃培养条件下诱导的蛋白占菌体总蛋白的比例分别为60%、83.8%、86.6%和88.1%。5.经western印迹鉴定,诱导表达的融合蛋白为试验所需要的目标蛋白。这为下一步制备PxPPO1和PxPPO2多克隆抗体,对PxPPO基因进行蛋白水平的分析和研究该酶的功能奠定了基础,为酚氧化酶调控昆虫生长发育及免疫反应的研究提供了新思路。6.球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的成熟孢子侵染菜青虫4龄幼虫试验表明,侵染6h-12h, PrPPO1的表达量显著降低,在6h和12h的表达量分别为对照的0.59倍和0.18倍。然而在侵染后72h PrPPO1的表达量大幅提高,约为对照表达量的9.00倍。在侵染后2h(1.12倍)、24h(0.33倍)、48h(1.06倍)PrPPO1的表达水平与对照相比没有显著性差异。7.统计了不同发育时期菜青虫血淋巴中类绛色细胞的数量,菜青虫4龄幼虫类绛色细胞密度为20.44×104个/mL。相对其他龄期密度最大,与菜青虫4龄幼虫较高的PrPPO1的表达量相一致。2龄和5龄幼虫类绛色细胞密度分别为13.78×104个/mL和13.33×104个/mL。相对而言,菜青虫1龄和3龄幼虫类绛色细胞密度较低,分别为10.22×104个/mL和8.89x104个/mL,与1龄和3龄PrPPO1的较低的表达量较一致。结果表明在菜青虫的不同发育时期PrPPO1的表达水平与类绛色细胞密度之间存在相应的关系。