低渗刺激可引起视上核星形胶质细胞合成释放抑制性递质牛磺酸,从而抑制神经元合成释放VP。已知脑内存在Glutamate mediated astrocyte-neuron signaling。SON是脑内的渗透压调节中枢之一,那么SON内是否存在Glutamate mediated astrocyte-neuron signaling,它在高渗刺激下是否起调节作用,其作用机制如何?为探索此问题本研究进行了三组实验(实验一、二和三)。此外,急慢性高渗刺激对胶质细胞的影响是否有所不同?我们进行了相关研究(实验四)。实验一急性静脉高渗刺激后SON神经元的反应依赖于AST的活性目的:观察急性静脉高渗(HS)刺激后,SON内AST和神经元的反应及其相互关系。方法:65只SD大鼠被分为4组:第1组正常对照组(n=5)不进行任何处理;第2组为等渗刺激组(IS, n=20),将等渗盐水(0.9% NaCl)注入尾静脉;第3组为高渗刺激组(HS, n=20),将高渗盐水(9% NaCl)注入尾静脉;第4组为氟代柠檬酸+ HS组(FCA plus HS组,n=20),预先向侧脑室缓慢注入1nmol/1 m的FCA,2h后再给高渗刺激;以上动物除第1组外,其余各组均分别存活15,45,90和180 min,每一时间点5只。常规灌流固定、切片,含有SON的切片进行抗VP,抗Fos,抗GFAP的单一或双重免疫荧光染色。同时HS刺激前以及刺激后45min,抽取各组大鼠静脉血,用放免法测定血浆VP含量。结果:1.急性静脉HS刺激后,SON内AST被激活,反应明显,表现为细胞胞体变大,突起变粗,GFAP深染,平均荧光强度增强,SON-VGL厚度增厚,Fos/GFAP双标细胞增加,以上反应在刺激后45min达到高峰。2.刺激后SON内神经元也被激活,Fos阳性胞核明显增加,VP阳性神经元的数目也显著增加,二者的高峰均为90min。3.FCA可明显干扰AST和神经元两者的反应。4.刺激后血浆VP水平显著升高,FCA预先处理再给HS刺激血浆VP水平不升高。结论:静脉HS刺激后SON内AST反应敏感,在刺激后45min达到高峰,神经元的Fos和VP表达高峰均为刺激后90min,血浆VP含量也升高。FCA是AST代谢抑制剂,以上AST和神经元的反应均被阻断;这表明SON内神经元对HS刺激的反应依赖于AST的活性。实验二静脉HS刺激后AST经Cx43 hemichannel释放Glu调节神经元活性目的:探讨HS刺激后SON内AST对神经元的调节机制。方法:1.整体动物实验:25只SD雄性大鼠被分为5组(5只/组):第1组为正常对照组;第2组为IS组;第3组为HS组;第4组为FCA plus HS组;第5组为甘珀酸+HS组(CBX plus HS组);第6组为PPADS+HS组;第7组为BBG+HS组。按实验一的方法制作动物模型,所有动物成活45min,常规固定、切片,切片进行抗NMDAR-2,抗glutamate,抗GFAP,抗Cx43,抗Fos,抗VP等单一或双重免疫荧光染色。2.培养细胞:使用2种细胞模型:(1)原代培养的AST,取18天胎鼠的下丘脑,常规分离、纯化培养AST 2周,将培养细胞分为6组:第1组为IS组(用不含Ca2+/Mg2+的DMEM培养);第2组为HS组;第3组为缝隙连接阻断剂(CBX和Gap26)+ HS组;第4组为谷氨酸转运体抑制剂(苏羟基天冬氨酸,THA)+ HS组,第5组为P2Xn受体拮抗剂(PPADS以及BBG)+ HS组,第6组为Ca2+螯合剂(BAPTA-AM)+ HS组,各组均处理1、3、5、7、9、10、12、15min。(2)C6细胞系,分组情况同上。分别收上述各组原代培养的AST培养液用于HPLC检测Glu含量。而采用流式细胞仪(FCM)测定C6细胞内Glu以及Cx43含量结果:1.整体动物实验:急性静脉HS刺激后,引起SON内下列变化:(1)AST的Glu表达明显上调,FCA干扰其上调,CBX则不干扰。(2)AST的Cx43表达明显上调,FCA干扰其上调,CBX则不干扰。(3)神经元NMDAR-2的表达明显上调,FCA和CBX均阻止其上调。(4)神经元内VP的表达上升,FCA,CBX均抑制VP的上升。2.培养细胞实验(1)HS刺激后,C6胞内Glu表达明显上升,3min达到高峰,以后下降。而原代AST培养液中Glu含量在5min达到高峰,此后呈下降趋势。(2)CBX或Gap26 + HS处理后,C6胞内Glu含量明显上升,并一直维持在高表达水平,而原代AST培养液中Glu含量与HS组相比,明显下降。(3)THA +HS组,与HS组相比,培养液中Glu含量未见明显差异。(4)PPADS或BBG + HS组,与HS组相比,细胞内和培养液中Glu含量均未见明显差异。(5)BAPTA-AM+HS组,与HS组相比,细胞内和培养液中Glu含量均未见明显差异。(6)培养细胞的Cx43表达也明显增加。结论:1.静脉HS后激活SON内AST,被激活的AST增加合成Glu,并通过Cx43 hemichannels释放,作用于SON神经元的NMDAR-2,增加VP的合成释放。2.HS激活培养的胶质细胞,增加Glu和Cx43的合成,CBX或Gap26不影响Glu的合成,但可阻断其释放;THA, PPADS,BBG和BAPTA-AM对Glu的合成、释放均无明显的影响。实验三高(低)渗刺激对胶质细胞释放递质的影响目的:探讨HS或低渗刺激后胶质细胞释放的递质是否不同?ATP是否参与对渗透压的调控。方法:1.培养细胞,本研究使用2种培养的胶质细胞模型:(1)原代培养的AST取18天胎鼠的下丘脑,常规分离、纯化培养2周;(2)C6细胞系。所有培养细胞分为3组:第1组为IS组;第2组为HS组;各组均处理1、3、5、10、15min。第3组为低渗刺激组;各组均处理1、3、5、10、15min。2.分别收上述各组培养液及细胞内液,采用HPLC测定原代培养AST细胞外液Glu以及taurine含量,而用FCM测定C6细胞内Glu以及taurine含量。3.采用荧光素-荧光素酶法检测原代培养的AST细胞内液及外液的ATP含量。结果:1.HS刺激促进AST主要合成释放Glu,而taurine未见变化2.低渗刺激促进AST主要合成释放taurine,而Glu未见变化3.与等渗组相比,渗透压发生改变后,细胞内外ATP水平未见显著变化。结论:HS刺激引起AST主要合成释放Glu,兴奋神经元释放VP。低渗刺激促进AST主要合成释放taurine,抑制神经元释放VP。而ATP未参与该调节过程。实验四急、慢性HS刺激对SON内AST和神经元影响的差异目的:探讨急、慢性HS刺激对大鼠行为学以及SON内AST和神经元影响的差异。方法:1.动物分组:25只SD雄性大鼠被分为5组(5只/组):第1组为正常对照组;第2组为2%高渗盐水喂养3d组;第3组为2%高渗盐水喂养6d组;第4组为2%高渗盐水喂养9d组;第5组为腹腔9%高渗盐水刺激组,动物成活45min。2.一般情况检测:测定大鼠体重以及进食3.测定各组大鼠的机械痛阈以及高级神经功能4.免疫荣光染色所有动物规定时间点处死,常规固定、切片,切片进行抗GFAP,抗VP,抗Fos,抗Cx43等单一,双重疫荧光染色。结果:1.急性腹腔高渗刺激45min后,SON内AST胞内GFAP与Cx43荧光强度明显上调,GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度增加,Fos/GFAP双标记细胞数目增多,同时AST的突起增长,变粗,胞体变大,呈活化型AST形态。此外VP和Fos阳性神经元的个数也显著增多。2.喂2%高渗盐水组(1)喂高渗盐水3d后,与对照组相比,Cx43及GFAP表达显著升高,GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度也增加,但低于急性腹腔高渗刺激组。Fos/GFAP双标记细胞数也显著增加,VP和Fos阳性神经元的个数也显著增多。此时,AST的突起有所回缩,细胞大小未见变化。(2)喂高渗盐水6d后,Cx43、GFAP的表达下降,GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度均明显降低,Fos/GFAP双标记细胞数以及VP和Fos阳性神经元的个数也显著减少,但仍高于对照组。(3)喂高渗盐水9d后,AST的突起回缩,胞体萎缩,Cx43、GFAP的表达明显下降,Fos/GFAP双标记细胞数,VP和Fos阳性神经元的个数也显著减少,GFAP标记的与Cx43标记的SON-VGL厚度均明显降低。(4)急性腹腔高渗刺激45min后,大鼠的机械痛阈、体重未见明显变化,而喂盐水3d后,大鼠的机械痛阈逐渐升高,体重变轻,进食量减少,至9d达到峰值,提示大鼠身体机能处于衰竭状态。明暗箱测定大鼠高级神经功能发现,大鼠学习记忆能力下降。结论:急性和慢性高渗刺激对AST有所不同,急性刺激可以激活AST,从而参与调节神经元的活性,而慢性高渗刺激后,在早期(3d)AST及神经元的活性明显增强,到后期(6,9d)大鼠身体机能处于衰竭,反应机能明显减退,AST和神经元的反应也就被明显抑制。