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在核移植过程中,供核细胞与受体胞质是重构胚的两个重要构件,尤其是受体胞质对重构胚核基因的重新编程及胚胎的发育至关重要。目前,大多数研究者都是采用MII期卵母细胞作为受体胞质。但是该方法由于在去核时要抽取大量胞质,而且还要用紫外线照射以检查去核是否完全,因而对细胞损伤大影响重构胚的发育。近年来有人采用激活MII期卵母细胞待其排出第二极体后,抽取第二极体及其周围少量含核的胞质来达到去核的目的,又称为TII期去核。这种方法由于抽取的胞质少,而且不需要紫外线的照射,故而对细胞的损伤较小。
许多实验室对该方法进行了研究,但是关于卵母细胞TII期去核对猪体细胞核移植重构胚发育的影响,目前国内还尚无相关报道。本论文主要研究和比较了猪卵母细胞TII期去核方法与效果,在此基础上还对猪卵母细胞TII期去核法生产核移植胚胎的程序进行了优化,为推广应用该技术生产猪的体细胞核移植胚胎提供一些数据和经验。
本实验在原有猪体细胞核移植技术的基础上,对影响猪卵母细胞TII期去核重构胚发育的几个因素(卵母细胞预激活程序、核移植后核质作用时间以及核供体细胞预处理方法)进行如下实验。
1、猪卵母细胞TII期预激活物质的选择。本实验以第二极体排出比率为指标,分别选择不同浓度的三种物质,作用于猪成熟卵母细胞观察统计预激活效果。5%、7%和10%乙醇浓度预激活猪卵母细胞排出第二极体的比率分别为20.83%(25/120)、25.00%(30/120)和22.50%(27/120);采用浓度为μg/mL、6μg/mL、8μg/mL,和10μg/mL的放线菌酮预激活猪卵母细胞后,第二极体的排出率分别为:16.67%(20/120)、19.17%(23/120)、25.83%(31/120)和20.83%(25/120);浓度为5μmol/mL、10μmol/mL、15μmol/mL和20μmol/mL钙离子载体A23187(CaA)预激活猪卵母细胞后第二极体的排出效果为54.17%(65/120)、58.33%(70/120)、64.17%(77/120)和57.50%(69/120),15μmol/mL,组效果最好,各浓度之间差异不显著(p>0.05)。比较以上三种物质预激活猪卵母细胞的效果发现15μmol/mL的CaA极显著优于其他两种物质(p<0.01)。
2、不同受体卵母细胞胞质对猪体细胞核移植的影响。本实验以重构胚卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率为检测统计指标,以MII期中期去核和TII期去核的卵母细胞作为受体胞质,经血清饥饿的卵丘细胞作为核供体构建重构胚胎,比较两种受体胞质对猪体细胞核移植效果的影响。结果表明:MII期中期去核的卵母细胞为核受体胞质的卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率均高于TII期去核的卵母细胞(31.67%vs24.17%,14.17%vs10.83%),差异显著(p<0.05)。说明,MII期中期去核的卵母细胞更适宜作为核移植受体胞质。 3、不同核质作用时间对猪体细胞核移植的影响。采用电融合法将卵丘细胞移入去核的卵母细胞中,供体细胞在TII期去核的受体胞质内分别孵育0h、1h、2h、3h、4h和5h后,1.3kV/cm、80μs、单次脉冲电激活重构胚,以重构胚卵裂率和4.细胞以上胚胎发育率为检测统计指标,比较不同核质孵育时间对核移植效果的影响。结果表明:核质孵育4h可以获得较好的核移植效果,其卵裂率(35.83%(45/120))显著高于其他几组(22.50%、25.83%、26.67%、28.83%、30.83%,p<0.05)。4-细胞以上胚胎发育率与孵育3h组差异不显著(12.50%vs12.50%,p>0.05)。但与其它几组相比差异显著(12.50%vs 4.17%,9.17%,10.00%,7.50%,p<0.05)。说明用TII期去核卵母细胞作为核受体胞质,核质孵育4h后再进行补充性电激活可以提高猪体细胞核移植重构胚的发育率。
4、不同供核细胞预处理方法对核移植效果的影响。本实验将经过血清饥饿处理的卵丘细胞作为对照组,分别用7%乙醇和钙离子载体A23187(5μmol/L)预处理供核细胞,核移植重构胚融合后,核质孵育4h再激活,比较两种预处理方法对核移植重构胚的影响。结果表明:用CaA预处理组的核移植重构胚的卵裂率(37.50%vs30.83%)和4-细胞以上胚胎发育率(15.83%vs10.83%)均高于对照组,差异显著(p<0.05)。卵裂率也略高于乙醇预处理组的核移植重构胚卵裂率(37.50%vs34.16%,p>0.05),但是4-细胞以上胚胎发育率显著高于乙醇预处理组(15.83%vs9.17%,p<0.05)。由此可见,TII期去核的卵母细胞作为核受体胞质,用钙离子载体预处理核供体细胞,核质孵育4h再激活重构胚,有利于核移植重构胚的发育。
综上所述,在以TII期去核的猪卵母细胞作为核受体胞质时,最适宜的程序是:用浓度为15μmol/mL钙离子载体处理卵母细胞5min,然后抽取第二极体及其周围少量胞质进行去核。供核细胞用5μmol/mL钙离子载体预处理后注入TII期去核的猪卵母细胞卵周隙内,采用参数为1.0kV/cm、80μs、单次脉冲电融合法移入供体细胞核,构建重构胚胎,此后,核质孵育4h,最后使用参数为1.3kV/cm、80μs、单次脉冲电激活重构胚,可以明显提高核移植重构胚的发育比率。简化核移植的操作程序。