论文部分内容阅读
多细胞生物的模式建成和生长发育依赖于干细胞的分裂和分化。动植物中的研究表明，干细胞的分裂、分化和维持通常由少数几个关键转录因子控制。因而，关键转录因子所控制的时空特异基因表达在特定器官的形态建成中起至关重要的作用。拟南芥根的模式建立和维持依赖于分生区中不同种类于细胞的活性。QC(quiescent center,QC)细胞和周围的干细胞共同构成了根尖干细胞微环境(stem cell niche，SCN)。在干细胞微环境中，皮层/内皮层干细胞(cortex/endodermis initial，CEI)及其子细胞(CEIdaughter cells，CEID)通过不对称分裂(asymmetric cell division，ACD)产生内皮层和皮层组织，这两层细胞共同被称为基本组织(ground tissue，GT)。两个植物特异的GRAS(GAI，RGA and SCR)家族蛋白SHORTROOT(SHR)和SCARECROW(SCR)在基本组织模式建成过程中发挥重要作用。SHR和SCR基因突变导致严重的基本组织模式建成缺陷。SHR-SCR复合体通过协调CYCD6;1等下游靶基因的转录过程介导了CEI/CEID的不对称分裂，从而调控基本组织模式建成。然而，目前尚不清楚SHR和SCR如何通过精细的分子机制将调控信号传递给RNA聚合酶Ⅱ通用转录机器，从而实现对靶基因的时空特异性表达调控。 中介体(Mediator)是进化上高度保守的多亚基蛋白复合物，被称为真核细胞基因转录的中央控制器。中介体最基本的功能是通过直接的相互作用连接特异转录因子和RNA聚合酶Ⅱ，介导转录预起始复合物(pre-initiation complex，PIC)的形成。理论上讲，特异转录因子在调控基因转录时，必须与特定的中介体亚基相互作用，进而建立与RNA聚合酶Ⅱ通用转录机器的直接联系。 为了建立SHR-SCR复合体和RNA聚合酶Ⅱ之间的直接联系，我们通过酵母双杂交实验筛选与SHR和/或SCR直接相互作用的中介体亚基。令人感兴趣的是，我们发现拟南芥中介体亚基MED31与SCR相互作用而不与SHR相互作用。体外pull-down实验和体内免疫共沉淀实验也验证了这一结果。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除MED31基因，得到med31-c突变体。纯合的med31-c突变体表现胚胎致死表型，这说明MED31的功能对于拟南芥早期胚胎发育是必需的。MED31-RNAi转基因植株的主根生长和干细胞微环境维持发生缺陷。进一步细胞学观察结果表明，MED31-RNAi中基本组织模式建成发生紊乱。遗传学证据表明MED31作用于SHR/SCR途径调控基本组织形成。MED31-RNAi植株中CYCD6;1的时空特异性表达发生紊乱，进而影响了CEI/CEID的不对称分裂。染色质免疫共沉淀实验结果表明，MED31以SCR依赖的方式被招募到CYCD6;1的启动子区。 遗传学和生物化学分析结果表明MED31参与了MED31-SCR-SHR三元复合体的形成。MED31和SHR可以影响彼此与SCR结合的能力，因此，MED31-SCR-SHR三元复合体是动态的。高浓度的SHR干扰SCR结合MED31;当SHR处于合适浓度时，SCR可以结合MED31，从而连接RNA聚合酶Ⅱ通用转录机器，启动下游靶基因CYCD6;1转录。综合上述结果，我们的研究表明MED31和SCR的动态相互作用决定了SHR-SCR复合体的转录输出，这与基本组织模式建成过程中干细胞的不对称分裂密切相关，该研究有助于进一步理解关键转录因子调控干细胞不对称分裂和器官模式建成的分子机理。