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头孢噻呋(Ceftiofur,CEF)是第三代头孢菌素类抗生素,也是第一个动物专用头孢菌素类抗生素。CEF通过靶向细菌细胞壁上的青霉素结合蛋白影响细菌细胞壁的合成,从而导致细菌细胞壁合成受阻发挥高效的杀菌作用。CEF的抗菌谱广泛,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和部分厌氧菌均具有良好的抗菌活性。此外,CEF还具有安全性高和休药期短的优势,是养殖业广泛使用的抗生素之一。然而,随着CEF的大量使用,其导致的细菌耐药性增强、药物残留等公共安全问题逐渐增多,对人类健康和疾病的治疗带来了潜在的危害。研究表明,CEF对光照、p H、微生物、温度敏感,在多种条件下均可发生降解。CEF热稳定性差,高温下易降解。鉴于工业化加工或家庭式烹饪,动物源性食品都需要经过加热环节,因此,残留的CEF可能会因热加工或烹饪而降解,且已有研究报道称牛奶、水中残留的CEF在不同加热条件下均会发生降解。但是,CEF降解后产物的毒性研究则未有报道。本研究以CEF为研究对象,模拟沸水煮制的烹饪方式,研究其加热后的毒性变化。通过检测CEF溶液不同加热时间光密度(Optical density,OD)值的变化和加热后对体外细胞的毒性研究,确定了CEF加热时间和毒性的关系;通过细胞增殖抑制试验、Hoechst 33342/PI荧光染色观察、流式细胞术等方法研究了加热后CEF的体外毒性。随后,通过高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)研究了CEF加热后的产物成分并进行了结构表征,并同时研究了CEF的体内代谢产物去呋喃酰基头孢噻呋(Desfuroylceftiofur,DFC)的热降解产物成分;通过化学合成的方式合成了CEF的热降解产物CEF-1,并进行了CEF-1对受试细胞的细胞毒性、细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生影响及线粒体膜电位变化影响的研究。最后,通过小鼠口服急性毒性实验、腹腔注射急性毒性实验和28天重复剂量口服毒性实验,研究了CEF加热后的体内毒性。我们的结果表明,CEF在加热后其颜色及OD值均发生了变化,提示其产生了热降解。细胞增殖抑制研究发现,热处理后的CEF(Thermally treated ceftiofur,TTC)对人正常肝细胞(LO2)、人胚肾细胞(293)、人胚二倍体肺细胞(MRC-5)增殖的抑制作用显著高于CEF原型。Hoechst 33342/PI荧光染色观察结果表明,TTC可以引起受试细胞凋亡和坏死。流式细胞术分析发现,TTC诱导受试细胞凋亡及坏死的作用显著强于CEF。通过LC-MS分析,我们发现CEF加热30 min和加热60 min后仅生成了一种热降解产物头孢噻呋醛(后以CEF-1代表),且DFC的热降解产物中同样含有CEF-1。通过研究合成CEF-1的细胞毒性,我们发现TTC对LO2的细胞毒性是由于热降解产生的CEF-1和未完全分解的CEF的相加作用所致,即,CEF-1是TTC中的唯一毒性产物。此外,ROS测定及线粒体膜电位试验结果发现,CEF-1可以引起细胞ROS水平升高、降低细胞线粒体膜电位,进而引起细胞凋亡。小鼠口服急性毒性实验结果表明,TTC无急性毒性,但会导致小鼠体重增长、肝脏细胞脂肪变性、高胆固醇血症、肝细胞线粒体损伤和脂肪酸β氧化障碍。小鼠腹腔注射急性毒性实验结果表明,加热30 min的CEF(TTC30)对受试小鼠的半数致死量(Median lethal dose,LD50)是CEF原型的1.2倍,而加热60 min的CEF(TTC60)的LD50是CEF原型的1.4倍。在给药剂量为1500 mg/kg时,CEF组336 h内的存活率为100%,而TTC30组4 h内的小鼠存活率仅为25%,而TTC60组4 h内的存活率为0%。此外,TTC可诱发肺充血并进一步发展为肺水肿,还可延长凝血时间、诱导肺泡内和血清中的ROS升高进而产生氧化应激损伤。28天重复剂量口服毒性实验结果表明,TTC可导致雄性小鼠脾脏器官指数增大、肺脏器官指数下降,造成雌性小鼠生殖器官的器官指数下降、降低小鼠的淋巴细胞数量、导致受试小鼠肝脏功能损伤。综上所述,我们发现,CEF的热降解产物CEF-1,能够通过氧化应激途径诱导细胞凋亡及坏死,引起显著的细胞毒性。在体内试验中,急性给予TTC同样可导致ROS升高,引发氧化应激损伤;且TTC具有重复剂量口服毒性,能够引起受试小鼠器官指数变化、淋巴细胞数量降低、肝功能损伤。动物源性食品中残留的CEF或DFC经烹饪等方式作用后,具有产生CEF-1的条件,因此,残留的CEF可能会造成潜在的公共健康和食品安全问题。