研究背景: 全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超过3.5亿人，并呈上升趋势，主要分布在亚洲和非洲，每年大约有一百万人死于HBV相关的肝脏疾病。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，占癌症死亡率第二位，严重威胁着人们的健康。HBV感染是肝癌发生的主要原因之一，流行病学调查表明，HBV感染者发生HCC的几率较正常人高100倍，但HBV致癌的具体机制尚不明确。 乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质相互作用，从而调节基因表达与细胞蛋白质功能，进而影响病毒自身的复制、宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡等重要过程，HBx的这些功能可能在HBV相关性HCC的发生、发展中起着重要作用，但其确切机制目前尚不太清楚，有待于进一步研究阐明。 研究表明细胞癌变与细胞周期失控密切相关，典型细胞周期包括有严格顺序的5个期即GO(静止期)→G1(合成前期)→S(合成期)→G2(合成后期)→M(分裂期)。细胞周期正常进行的关键在于细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶家中山大学硕士学位论文乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞生长、增殖的调控及机制研究族(CDKs)的活化，而CDKs受细胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正负调节。已发现的8种cyclin中，尤以cyclin D家族对细胞增殖具有最重要的意义，实验表明，阻滞cyclin D的表达则细胞不能从G1期→S期，而其过表达则G1期缩短。当G1期缩短，细胞生长加速，并使得DNA受到损伤的细胞无法得到有效修复，从而可能发生肿瘤。 p16为抑癌基因，属于周期依赖性激酶抑制因子(CDKI)基因家族，定位于人染色体9p21，编码的P16蛋白为CDK4/6抑制剂，对CDK4/6有高度亲和性，在细胞增殖的调控中，P16蛋白与cyclin D1竞争与CDK4/6结合，对细胞周期发挥负性调节作用。通过此作用阻止细胞周期通过G1/S检验点，在调节细胞增殖与凋亡、阻止有DNA损伤的细胞进行分裂增殖中具有关键的作用。P16蛋白的失活可导致细胞周期缩短，生长加快。 DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物,DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化是基因表达降低或缺如的主要机制，是调控基因表达的重要方式。正常的甲基化在维持细胞基因组的稳定性、维持细胞和器官正常功能及个体的发育、分化、生长、衰老起着重要作用，而异常甲基化导致一些抑癌基因及生长调控基因失活从而在肿瘤形成中起了重要作用。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指双链RNA诱导同源mRNA降解从而导致基因表达降低或缺如的现象，又称为基因沉默。利用RNAi的这种特性，可以设计与已知基因mRNA同源的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，导入细胞或动物体内，使特定基因表达沉默。 研究目的：1、了解HBV X蛋白对肝癌细胞周期、生长的调控作用及机制。2、探讨HBV X蛋白是否通过影响p16基因甲基化而调控肝癌细胞生长、增殖。 实验方法: 以稳定表达GFP/HBV X融合蛋白的HepG2细胞系(HepG2/GFP-HBx)和自然整合有HBV DNA及表达HBV X蛋白的亚历山大肝癌细胞(PLC/PRF/5)作为本课题的实验系统。设计、合成靶向adr、adw亚型HBV X基因的小分子干扰RNA(X-siRNA-1，X-siRNA-2)及非特异性neg-siRNA。将各siRNA分别转染HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5细胞，半定量RT-PCR检测HBV X基因转录、表达，MTT法检测各种因素处理肝癌细胞的生长情况。应用甲基转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5umol/1)处理HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5细胞，流式细胞术检测各siRNA转染及5-氮-2’-脱氧胞苷处理的肝癌细胞的细胞周期，甲基化PCR(MSP)检测各组细胞p16基因甲基化情况。采用阿霉素(Addamycin Adr)(2.0ug/ml)分别处理HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5细胞，阿霉素处理后36小时，TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。采用SPSS 10.0统计软件，两组问差异用χ2检验，P<0.05认为差异有统计学意义。 实验结果: MTT检测表明与HepG2和HepG2-GFP组相比，HepG2-GFP/χ组细胞生长速度加快，指数生长期提前。RT-PCR检测示，X-siRNA-1、X-siRNA-2转染的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5细胞，HBV X基因mRNA电泳条带的相对灰度值分别为0.30±0.04、0.21±0.04，较空白对照细胞及neg-siRNA的(1.01±0.03、0.91±0.01)和(1.13±0.03、1.09±0.06)显著降低(P<0.05)，同时，MTT法检测显示X-siRNA-1、X-siRNA-2转染的肝癌细胞生长减慢。流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx细胞G0/G1期细胞百分比(16.22±0.45)％，较HepG2、HepG2/GFP的(45.11±1.21)％、(41.25±1.46)％显著减少(P<0.05)，细胞分裂周期缩短。HBV X特异性siRNA转染的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5细胞G0/G1期分别为(36.924±1.15)％、(65.46±2.09)％，较空白对照细胞组(16.22±0.45)％、(47.50±1.46)％显著增加(P<0.05)，细胞阻滞于G0/G1期，细胞分裂周期延长。甲基化抑制剂5-氮-21-脱氧胞苷处理后HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5细胞G0/G1期细胞百分比分别达到(33.09±0.92)％、(57.96±2.16)％，较空白对照组细胞增加(P<0.05)，而5-氮-21-脱氧胞苷处理后，HepG2、HepG2/GFP细胞G0/G1期细胞百分比分别是(44.85±1.54)％、(41.05±1.52)中山大学硕士学位论文乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞生长、增殖的调控及机制研究％，较空白对照组无明显差异(P>0.05)。 MSP检测表明，表达GFP/HBx融合蛋白、HBx的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5肝癌细胞出现了p16基因甲基化，不表达HBx的对照细胞未见可检测的p16基因甲基化；靶向HBV X的siRNA转染及5-氮-21-脱氧胞苷处理的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5肝癌细胞p16基因甲基化降低。 TUNEL法检测显示，阿霉素处理36小时后HepG2、HepG2/GFP细胞出现了明显的凋亡，凋亡率分别为(57.2±2.2)％、(59.4±2.5)％，明显高于HepG2/GFP-HBx细胞(3.9±0.6)％及未转染的对照组细胞(2.1±0.4)％、(2.7±0.5)％、(2.9±0.4)％(P<0.05)。而在转染了X-siRNA-1的HepG2/GFP-HBx细胞，阿霉素处理36小时后出现了明显的凋亡(55.6±2.7)％，明显高于未转染细胞及neg-siRNA转染的HepG2/GFP-HBx细胞(4.1±0.4)％，与对照细胞无明显差别(P>0.05)。表明特异性靶向HBV X的siRNA可以逆转HBV X的抗凋亡作用。阿霉素处理36小时后PLC/PRF/5细胞的凋亡率仅为(1.7±0.3)％，与空白对照组细胞凋亡率(1.4±O．3)％无明显差别(P>0.05)。而在转染了X-siRNA-2的PLC/PRF/5细胞，阿霉素处理36小时后出现了明显的凋亡，凋亡率达(67.0±3.0)％，与未转染组有明显差别(P<0.05)。但在转染了neg-siRNA的PLC/PRF/5肝癌细胞，阿霉素处理36小时后未出现明显的凋亡，凋亡率为(4.0±0.3)％，与空白对照组细胞无明显差别(P>0.05)。 结论:1、HBVX蛋白能够诱导p16基因甲基化。 2、HBV X蛋白能够缩短肝癌细胞周期的G0/G1进程而促进肝癌细胞的生长、增殖，其对细胞周期的作用可能是通过诱导p16基因甲基化所致。 3、HBV X蛋白能够抑制阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡。 4、靶向HBV X的干扰RNA能有效抑制HBV X基因的转录表达，进而逆转HBV X蛋白的促进肝癌细胞生长和抑制细胞凋亡的作用。