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肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一和癌症相关死亡的首要原因。根据病理类型不同,肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC);其中NSCLC为最常见的病理类型,约占肺癌患者总数的85%左右。由于肺癌早期缺乏特异性的临床症状,多数NSCLC患者就诊时已属晚期。近年来,以抗PD-1/PD-L1为代表的免疫治疗发展迅速,为晚期NSCLC特别是驱动基因阴性患者提供了新的治疗手段,显著改善患者生存预后,已成为晚期NSCLC的主要治疗手段之一。抗PD-1/PD-L1免疫治疗虽然能明显延长晚期NSCLC的无进展生存期和总生存期,具有长期生存获益的优势,但其有效率却较低。因此,阐明影响免疫治疗敏感性的因素和参与机制具有重要的理论研究意义和临床应用价值。研究表明,NSCLC对抗PD-1/PD-L1免疫治疗的敏感性不仅与肿瘤细胞自身特性有关,其所处的肿瘤微环境也是影响肿瘤免疫治疗敏感性的关键因素。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有多向分化潜的干细胞,几乎存在于所有组织类型中,参与组织损伤修复等过程。研究表明,MSCs可迁移至肿瘤局部,成为肿瘤微环境的重要组成,参与调控肿瘤细胞凋亡、上皮间质转化、干细胞增殖、血管形成及局部免疫应答等过程。近年来,研究者对MSCs与肿瘤的作用进行了大量的研究。研究显示,MSCs不仅可以促进肿瘤细胞生长,还可以通过释放免疫抑制因子IL-10、一氧化氮和犬尿酸抑制抗肿瘤免疫反应并促进其转移。MSCs还在肿瘤化疗、放疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗抵抗中发挥重要作用。然而,关于肿瘤微环境中的MSCs对免疫治疗敏感性的影响及相关机制研究甚少。本研究通过体内实验较为系统的研究MSCs对NSCLC抗PD-1免疫治疗敏感性的影响及其相关机制,并通过临床数据分析进一步验证。第一部分间充质干细胞对非小细胞肺癌抗PD-1免疫治疗敏感性影响及机制研究研究目的:通过肺癌荷瘤小鼠模型研究MSCs对NSCLC免疫治疗敏感性的影响,并探索其可能的参与机制。研究方法:1.常规培养 MSCs 及 Lewis 肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞;2.通过皮下注射建立荷瘤小鼠模型,皮下注射给予MSCs,腹腔注射抗PD-1抗体,定期测量肿瘤大小,记录其对肿瘤生长的影响。3.按计划处死小鼠,测量肿瘤大小和重量,分离肿瘤组织、取小鼠外周血用于后续试验。4.流式细胞术检测小鼠外周血免疫抑制细胞比例。5.流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中免疫抑制细胞比例。研究结果:1.成功培养MSCs,共聚焦显微镜观察、记录其形态。2.LLC荷瘤小鼠试验结果表明,抗PD-1抗体显著抑制LLC体内生长(LLC+抗PD-1组vs LLC对照组,P<0.05),给予MSCs后明显逆转了抗PD-1抗体的体内抑瘤作用(LLC+MSCs+抗PD-1 组 vs LLC+抗PD-1 组,P<0.05)。3.流式细胞术检测不同处理组外周血免疫抑制细胞比例,结果表明:LLC+MSCs+抗PD-1 Ab组与LLC+抗PD-1 Ab组相比PMN-MDSCs、M-MDSCs、TAMs细胞的比例显著增加,P<0.05;LLC+抗PD-1 Ab组与LLC对照组相比PMN-MDSCs细胞的比例显著减少,P<0.05。4.流式细胞术检测不同处理组肿瘤组织中免疫抑制细胞浸润比例,结果表明:LLC+MSCs+抗PD-1 Ab组与LLC+抗PD-1 Ab组相比PMN-MDSCs细胞的比例显著增加,P<0.05;M-MDSCs、TAMs细胞的比例均无明显差异,P>0.05;LLC对照组与LLC+抗PD-1 Ab组相比PMN-MDSCs、M-MDSCs、TAMs细胞的比例均无明显差异,P>0.05。结论:荷瘤小鼠模型表明,MSCs这一肿瘤微环境重要组成显著降低了抗PD-1抗体的体内抑瘤作用,进一步检测发现肿瘤组织和外周血PMN-MDSCs、M-MDSCs、TAMs这些免疫抑制细胞比例增加,提示MSCs可能通过促进这些免疫抑制细胞募集从而导致免疫治疗敏感性下降。第二部分血管紧张素Ⅱ 受体基因表达对非小细胞肺癌预后的意义及其机制研究目的:抑制性肿瘤免疫微环境的形成是导致肿瘤免疫治疗失败的主要原因。在第一部分研究中,我们发现MDSCs浸润的比例增加,但其机制尚不明确。已有研究表明,血管紧张素Ⅱ是导致MDSCs、TAMs及Tregs浸润的主要原因,通过与其受体AT1R结合发挥作用。目前,在NSCLC中血管紧张素Ⅱ或其受体与MDSCs、TAMs及Tregs浸润的关系尚不明确。在本部分研究中,我们通过癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,探究血管紧张素Ⅱ受体(angiotensin Ⅱ receptor,AGTR)基因表达与NSCLC患者的预后的相关性,并从肿瘤浸润淋巴细胞的角度来研究影响预后的因素。研究方法:1.从TCGA数据库中获取NSCLC患者的AGTR1、AGTR2基因表达情况、预后生存资料、肿瘤浸润淋巴细胞的数据。2.应用在线分析网站GEPIA分析AGTR1及AGTR2基因表达丰度与NSCLC总生存期之间的关系。3.应用在线分析网站TISIDB分析AGTR1及AGTR2基因表达与肺鳞癌、肺腺癌肿瘤组织中免疫细胞浸润的相关性。其中所分析的肿瘤浸润淋巴细胞包括MDSCs、TAMs 和 Tregs。4.统计学分析:采用Spearman相关性检验分析AGTR1、AGTR2基因表达与肿瘤浸润淋巴细胞之间的相关性。采用Kaplan-Meier方法进行生存分析,分析结果应用Log-rank检验进行组间对比。P值<0.05为被认为差异具有统计学意义。研究结果:1.NSCLC患者AGTR1基因表达丰度cut-off值与生存分析以OS为终点计算出AGTR1基因表达丰度的cut-off值为55%,以cut-off值为界将AGTR1表达丰度分为低AGTR1组(≤55%)和高AGTR1组(>55%)。肺鳞癌患者低AGTR1组的预后好于高AGTR1组(P=0.034)。肺腺癌AGTR1基因表达丰度与肺腺癌预后无相关性(P=0.11)。2.NSCLC中AGTR1基因与TILs浸润的相关性AGTR1基因表达与肺癌组织中MDSCs(肺鳞癌P<0.001、肺腺癌P=0.0387)、TAMs(肺鳞癌 P<0.001、肺腺癌 P<0.001)及 Tregs(肺鳞癌 P<0.001、肺腺癌P<0.001)浸润均具有正相关性。3.NSCLC患者AGTR2基因表达丰度cut-off值与生存分析以OS为终点计算出AGTR2基因表达丰度的cut-off值为52%,以cut-off值为界将AGTR2表达丰度分为低AGTR2组(≤52%)和高AGTR2组(>52%)。AGTR2基因表达丰度与NSCLC预后无关(肺鳞癌P=0.063、肺腺癌P==0.11)。4.NSCLC中AGTR2基因表达与肿瘤浸润淋巴细胞的相关性AGTR2基因表达与肺癌组织中MDSCs、TAMs、Tregs浸润相关性较弱。研究结论:AT1R的编码基因AGTR1高表达与肺鳞癌预后不良显著相关,并可显著增加肿瘤微环境中免疫抑制细胞MDSCs、TAMs及Tregs的浸润;而与肺腺癌的预后无明显相关性。AT2R的编码基因AGTR2的表达高低与NSCLC的预后无明显相关性。