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背 景近年来,多项研究如糖尿病控制和并发症试验后续研究EDCI等已经证实,早期严格控制血糖可以减少心血管疾病发生率。这提示人们要关注持续性高血糖之外,还应对高血糖遗留的“代谢记忆”现象（MM）予以重视。表观遗传修饰是近年来用于解释MM的主要机制;其中关于糖尿病代谢记忆中非编码RNA（ncRNA）调节机制的研究逐年增多,但缺乏对血管内皮细胞在高糖诱导下MM的系统性ncRNA研究。作为动脉粥样硬化的进程关键的起始环节,内皮细胞功能紊乱的作用是不言而喻的。研究MM中内皮细胞非编码RNA调节机制有利于拓展临床针对糖尿病血管病变的新疗法。基于目前ncRNA参与基因表达调节机制比较明确的是内源性竞争RNA（ceRNA）机制,我们决定以miRNA结合靶基因并抑制其表达为起始,探索MM中可能作用于miRNA的上游circRNA、下游靶基因的互作以及这种互作对细胞功能的影响。不同于单个ncRNA的研究策略,我们首先对MM模型中mRNA、miRNA、circRNA各自的表达做一个了解,分析哪些变化是MM相关的;其次联合分析这些差异表达RNA,进一步筛选MM中可能存在的circRNA-miRNA-mRNA互作调节轴;最后选择一个感兴趣目标进行验证。本研究能增添血管内皮细胞代谢记忆下非编码RNA调节机制的新证据;为今后的研究提供丰富的理论依据、提供ncRNA参与调节MM研究的新目标分子。第一部分高糖诱导的血管内皮细胞“代谢记忆”差异表达mRNA的研究[目的]本研究中,我们从转录组水平上筛选MM中HUVECs差异表达的基因并探讨它们功能的关系,以期为后续研究开展提供目标分子。[方法]1.传代培养的第3～10代HUVECs细胞分3组:（1）低糖对照组（LG）,含5 mM葡萄糖+20 mM甘露醇的培养基培养6天;（2）高糖维持组（HG）,含25mM葡萄糖的培养基培养6天;（3）代谢记忆组（MM）,含25mM葡萄糖的培养基培养3天后,改为含5mM葡萄糖+20 mM甘露醇的培养基继续培养3天。6天结束时行细胞形态学观察和MTT检测细胞活性、收集各组细胞待检。2.用miRNA Isolation Kit提取总RNA,并完成纯化和质检;取LG、HG和MM条件下HUVECs共9例样本的各自总RNA 5 ug,用于cDNA文库构建和文库质检,最后在Illumina 2500测序仪上完成Cluster生成和测序。对测序数据进行处理,为后续的差异表达基因分析做准备。3.用edgeR完成差异表达基因分析,获得高糖诱导的MM相关差异表达基因（HGMMGs）:（1）HG组与LG组、MM组与LG组进行差异表达分析（|FC（Fold Change）|≥1.2、p<0.05）,得显著性差异表达基因,（2）分析MM组与HG组之间无显著性差异的基因（p≥0.05）,即MM中保持的HG组因高糖导致的异常表达;二者取交集,代表MM相关的失调基因。4.鉴定HG诱导MM涉及的上调基因（up-HGMMGs）和HG诱导MM涉及下调基因（down-HGMMGs）。利用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析基因的生物功能和信号传导途径,构建蛋白质-蛋白质互作网络,进行基于MCODE算法的蛋白互作网络聚类分析。5.用TRIzol试剂提取样本的RNA,以qPCR对随机抽取的MM相关的差异表达基因测序结果进行验证。[结果]1.HG组和MM组的细胞活力比LG组下降。各组细胞提取的总RNA浓度、纯度和完整性优秀,本次测序结果质检合格,满足后续分析的要求。2.共鉴定出726个HGMMGs,包括210个down-HGMMGs和516个up-HGMMGs;它们在细胞周期、卵母细胞减数分裂、p53信号通路和氧化磷酸化等功能通路显著富集。蛋白质相互作用（PPI）网络由462个节点和2656个连接组成,MCODE鉴定出4个主要模块,分别包含49、12、11及8个互作蛋白质。3.随机抽取的差异表达基因CDK1、CCNB1、CCNA2、CDK6、RPL11和CREB1的实时PCR结果与RNA-seq的结果一致,证明RNA-seq结果是可信的。[结论]我们首次以RNA-seq鉴定出在环境葡萄糖浓度转换到正常水平后,MM持续存在与内皮细胞功能相关表达异常的mRNAs;细胞周期、卵母细胞减数分裂、p53信号通路和氧化磷酸化等可能是高糖诱导内皮细胞MM的潜在治疗靶点。深入研究这些基因在MM中的作用可能会为糖尿病血管并发症治疗带来新的策略。第二部分高糖诱导的血管内皮细胞“代谢记忆”差异表达mi RNA研究[目的]用small RNA测序来分析MM的HUVECs的miRNA表达谱,找出MM相关的有显著性差异miRNA（MMmis）,并分析相关靶基因的功能。[方法]1.第3～10代HUVECs细胞被分为3组:（1）低糖对照组（LG）;（2）高糖维持组（HG）;（3）代谢记忆组（MM）。各组的培养条件同第一部分“高糖诱导的血管内皮细胞’代谢记忆’差异表达mRNA研究”。2.总RNA提取、纯化、质检;cDNA文库构建和文库质检过程同第一部分“高糖诱导的血管内皮细胞’代谢记忆’差异表达mRNA研究”;测序选用single-read的单端测序;用Fastx、Bowtie等软件对测序数据进行处理,为后续的差异表达分析做准备。3.用edgeR完成差异化表达基因分析,获得高糖诱导的MM相关差异表达MMmis:（1）HG组与LG组、MM组与LG组进行差异表达分析,得显著性差异化表达基因（|FC|≥2.0、p<0.05）,（2）分析MM组与HG组之间无显著性差异的MMmis（p≥0.05）;二者取交集,代表MM相关的差异表达MMmis。4.用mirwalk、mirtarbase数据库对差异miRNA进行3’ 端UTR进行靶基因预测;clusterProfiler软件包进行MMmis的靶基因GO和KEGG分析,探索MMmis功能与MM的关系。5.以qPCR对随机抽取的MMmis的测序结果进行验证。[结果]1.本次测序结果的基因比对满意,测序共鉴定获得1413已知miRNA和101未知miRNA,测序量足够,满足后续分析的要求。2.共鉴定出MM相关的上调MMmis（up-MMmis）15个,下调MMmis 9个（down-MMmis）。经过预测,这些MMmis的靶基因共12979个,GO富集分析显示,这些基因功能与氮化合物代谢过程的调节、代谢的调节、蛋白质结合及信号通路调节等重要生物进程有关;KEGG分析显示这些基因富集的生物功能通路主要有:细胞粘附分子、Wnt信号通路、黏着连接以及影响炎症和细胞增殖的ErbB 信号通路、MAPK 信号通路等。miR-181b-5p、miR-150-5p、miR-370-3p、miR-365a-5p、miR-769-5p、miR-143-3p、hsa-miR-205-5p 及 hsa-miR-1260b 的异常表达可能参与了 MM引起的PI3K通路活性异常、内质网应激损伤及动脉粥样硬化（AS）形成等过程。3.随机抽取的 hsa-miR-143-3p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-1307-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-375-5p 及 hsa-miR-192-5p 的实时 PCR 结果与 RNA-seq结果一致。[结论]我们鉴定出了在环境葡萄糖浓度转换到正常水平后,MM组持续存在的异常表达 miRNAs;提出有意义的通路:（1）miR-181b-5p、miR-150-5p、miR-370-3p、miR-365a-5p和miR-769-5p共同的靶基因PIK3R3可能是这些异常表达miRNA参与MM形成的关键靶分子。（2）MM中上调表达miR-181b-5p、miR-143-3p可能是MM遗留后续内质网应激损伤的重要损害性因子。（3）MM中,hsa-miR-375,hsa-miR-205-5p,hsa-miR-1260b,hsa-miR-192-5p 等下调 miRNA 可能会增加促动脉粥样硬化基因的表达。第三部分高糖诱导的血管内皮细胞“代谢记忆”差异表达circRNA研究[目的]为探讨 circRNA-miRNA-mRNA 的内源竞争 RNAs（competing endogenous RNAs,ceRNA）在MM中的作用。[方法]1.第3～10代HUVECs细胞分组与培养条件同第一部分“高糖诱导的血管内皮细胞’代谢记忆’差异表达mRNA研究”。2.测序方法同第一部分“高糖诱导的血管内皮细胞 ’代谢记忆’差异表达mRNA研究”。用FastQC、BWA-MEM、circBase等软件对测序数据进行处理,为下一步分析做准备。3.用edgeR分析获得高糖诱导的MM相关circRNA（MMcis）:（1）HG组与LG组、MM组与LG组差异表达进行分析（|FC|≥2.0、p<0.05）,得显著性差异化表达基因,（2）分析MM组与HG组之间无显著性差异的MMcis（p≥0.05）;二者取交集,代表MM相关的差异表达MMcis。对筛选出的MMcis进行亲本基因特征分析以及预测的circRNA-miRNA互作分析。4.基于各种RNA实际表达的ceRNA分析。（1）同上获得MMcis（|FC|>2,p<0.05）。（2）预测 MMcis 的互补 miRNA。mirwalk、mirtarbase 数据库预测 miRNA靶基因。（3）R包HSMAC计算各RNA实际表达值之间相关性。取circRNA-mRNA呈正相关、circRNA-miRNA呈负相关、miRNA-mRNA负相关3个条件的变化关系对（p均<0.05）。（4）将（3）和（2）的结果取交集获得兼有结合潜力又有表达相关性的ceRNA对子;对重要的ceRNA作用对子进行功能分析。5.对随机抽取的MMcis测序结果以qPCR法进行验证。[结果]1.测序质控数据同第一部分“高糖诱导的血管内皮细胞“代谢记忆”差异表达mRNA研究”。circbase注释已知9135个circRNAs,这些circRNA大多数来源于蛋白质编码基因的外显子。2.共鉴定出MM相关MMcis 22个,其中上调MMcis 12（up-MMmis）个、下调 MMcis 10（down-MMmis）个。hsacirc0002317 是基因间 circRNAs,其余是外显子circRNA和内含子circRNAs,来源于21个亲本基因;hsacirc0006137、hsacirc0025638、hsacirc0087015的合成过程可能会影响亲本基因的线性RNA表达,从而对AS形成、细胞凋亡和衰老、细胞自噬等功能产生影响。22个MMcis含有丰富的miRNA反应元件（MREs）,存在多种基于miRNA靶向调控基因的ceRNA作用可能,我们还建立了这些预测circRNA-miRNA互作网络图。3.circRNA、miRNA、mRNA的ceRNA机制分析。经过筛选,共得到MM相关的差异表达的circRNA 18个、miRNA 15个及mRNA 351个;预测分析显示这些差异表达RNA共形成38个circRNA-miRNA靶向关系、573个miRNA-mRNA靶向关系;进一步的GO和KEGG分析显示了以下ceRNA作用需要被重视:（1）MM 中高表达的 hsacirc0002317 通过靶向 miR-455-5p/miR-365a-5p/miR-522-3p间接调节DEPDC1B/PRKD2/PRR11等基因的表达,可参与细胞周期与自噬功能的调节;（2）MM中高表达hsacirc0000215可能会通过靶向miR-152-5p/miR-205-5p/miR-365a-5p/miR-769-5P 间接上调靶基因 CDK1/ID3/AURKA/MAPK1等细胞周期蛋白、细胞周期调控激酶、细胞自噬活性的调节,可通过内皮细胞增殖、凋亡等功能紊乱影响糖尿病血管并发症的发生;（3）MM组中显著低表达 hsa-circ0005263,靶向 miR-150-5p/miR-504-5p/miR-590-3p/miR-346 间接下调靶基因 ATP1B1/SAMD4A/GCLM/CDK6/ATP6V1E1/RPL14等,这些ceRNA作用可能会影响内皮细胞氧化还原稳态和抗氧化反应的维持能力,产生MM的后续损害。4.qPCR验证结果证实RNA-seq结果可靠。[结论]我们筛选出代谢记忆中持续异常表达的circRNA,提出MM中有可能发挥调节作用的 ceRNA 轴:（1）hsacirc0002317、miR-455-5p/miR-365a-5p/miR-522-3p、DEPDC1B/PRKD2/PRR11 调 节 轴;（2）hsacirc0000215、miR-152-5p/miR-205-5p/miR-365a-5p/miR-769-5P、CDK1/ID3/AURKA/MAPK1调节轴;（3）hsacirc0005263、miR-150-5p/miR-504-5p/miR-590-3p/miR-346、ATP1B1/SAMD4A/GCLM/CDK6/ATP6V1E1/RPL14 调节轴。第四部分HUVECs代谢记忆中circ-0000215作为miR-769-5p“海绵”功能的研究[目的]基于前面的研究结果,初步验证代谢记忆中circ0000215是否通过miRNA影响MAPK1的表达,是否影响自噬的活性。[方法]1.HUVECs细胞培养条件同“第一部分高糖诱导的血管内皮细胞’代谢记忆’差异表达mRNA研究”,进行qPCR验证各RNA表达。siRNA干扰HUVECs细胞后分别进入高糖组（HG）、代谢记忆（MM）组进行circRNA功能实验。2.qPCR 定量检测各 HG、MM 及 LG 组 circ 0000215、miR-769-5p、MAPK1的表达值;以circ-0000215 siRNA干扰HUVECs,观察HG组和MM组中circ 0000215、miR-769-5p、MAPK1 的基因表达变化,以 Western blot检测MAPK1、mTORC1及LC3蛋白表达值的变化;以MTT法检测细胞生长活力。3.针对MAPK1、circ 0000215基因3’UTR端miR-769-5p结合位点序列分别设计wt和mut型pmirGLO重组载体质粒,并设置pmirGLO载体为对照;分别给予miR-769-5p mimics或miR-769-5p NC转染。以293T细胞中萤火虫荧光素酶表达值判断miR-769-5p是否与靶基因位点结合。[结果]l.qPCR 结果显示 HG、MM 组 circ 0000215、MAPK1 表达高于 LG 组（p<0.001）,而 miR-769-5p 表达低于 LG 组（p<0.001）;2.siRNA干扰实验表明,无论是在HG还是MM组,circ 0000215 siRNA沉默circ 0000215 后circ0000215、MAPK1表达下降（p均<0.001）,miR-769-5p表达值升高（p<0.001）;无论是HG还是MM组,circ0000215 siRNA干扰后,HUVECs中蛋白ERK1/2、mTORC1表达下降（P<0.01）,而LC3 Ⅱ表达增加（P<0.01）。MTT检测显示circRNA siRNA干预后HG和MM组均可提高40%左右的细胞活力（P<0.001）。3.双荧光素酶报告实验显示:与miR-769-5p NC+pmirGLO-MAPK1组相比,转染miR-769-5p mimics+pmirGLO-MAPK1组的荧光素酶活性显著降低（P<0.01）;与 miR-769-5p NC+pmirGLOcirc 000215 组相 比,转染 miR-769-5p mimics+pmirGLO-circ000215重组载体质粒组荧光素酶活性降低（P<0.01）。结果显示miR-769-5p可以直接与circ 000215及MAPK1的3’UTR端结合位点结合。[结论]MM组HUVECs保留与HG一样的变化:高表达hsa circ 0000215和MAPK1,低表达miR-769-5p。沉默circ 0000215会引起自噬通路蛋白mTORC1低表达、LC3 Ⅱ高表达;可能会增加自噬、促进细胞生存。经双荧光素报告实验证实了miR-769-5p可以作用于circ0000215、MAPK1基因的3’UTR结合位点。circ0000215及miR-769-5p可能是治疗MM自噬功能下降的潜在靶点。全文总结论1.通过转录组测序,我们首次系统的描述了高糖MM中HUVECs的mRNAs、miRNA及circRNA表达谱的整体观;为今后的研究提供了理论依据。2.对代谢记忆中持续保持与高糖时一样变化的各种RNA进行分析,了解到MM时的异常表达之mRNA与细胞周期、p53等信号通路等异常有关;并分析得到MM中miRNA及circRNA参与的血管损伤“记忆”可能机制,包括内质网应激、动脉粥样硬化形成及细胞自噬功能异常等,可为以后研究提供标靶。3.联合分析差异表达的各种RNA,我们凝练出一些与MM损伤机制有关的基于miRNA的ceRNA作用对子,充分说明了在高糖MM中,ncRNA参与的广泛性,并选择代表性的circ0000215及miR-769-5p及MAPK1验证了它们互作的ceRNA机制,本研究提供了 ncRNA参与调节MM影响血管内皮细胞功能ceRNA机制的证据以及新的研究目标。