胃癌的发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤第二位,是威胁我国居民生命健康最主要的恶性肿瘤之一。胃癌是环境与遗传因素共同作用的结果,在环境暴露的诱导下,遗传因素将在一定程度上决定个体对胃癌的易感程度。全基因组关联研究（Genome Wide Association Study,GWAS）作为一种高效的遗传关联研究策略已广泛应用于包括胃癌在内的多种复杂性疾病的遗传易感性研究。近10年来,胃癌GWAS已成功鉴定了染色体1q22、3q13.31、5p13.1、5q14.3、6p21.1、6p22.1、8q24.3、9q34.2、10q23.33、12q24.11-12和20q11.21区域常见遗传变异与胃癌易感性的关联。然而,与其他常见恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌）相比,在胃癌中发现的遗传易感位点仍然较少,其可解释的遗传度较小,尚存在大量未知的遗传位点有待进一步探究。此外,既往的GWAS是基于“常见疾病/常见变异”的遗传假说开展的,其发现的常见遗传变异（次要等位基因频率,MAF≥5%）大多为标签位点,代表了一组存在连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）关系的多个遗传变异。这些遗传变异单个风险位点的效应往往较低,OR值一般小于1.5,且大多位于染色体非编码区,导致GWAS发现的绝大部分易感位点生物学功能不明,真正的致病位点难以确定。因此,尽管GWAS在揭示胃癌等复杂性疾病易感性方面取得了巨大的成功,但仍存在许多需要解决的科学问题。为了进一步完善中国人群的胃癌遗传图谱,深入理解遗传变异在胃癌发生中的作用及其分子机制,本研究首先采用Exome Beadchip的分型技术,基于大样本多阶段的病例-对照研究设计,探讨低频遗传变异与中国人群胃癌发生风险的关联;其次基于OncoArray芯片,整合既往中国人群胃癌GWAS数据,进一步通过功能注释和生物学实验探讨易感区域遗传变异的功能及其在胃癌发生中的生物学机制。本研究结果对于进一步发现中国人群胃癌遗传标志物,探讨胃癌发生机制和促进个体化治疗等方面具有重要的理论价值和现实意义。第一部分染色体1p35.2区域SPOCD1低频遗传变异与胃癌易感性的关联及其机制研究传统GWAS通常仅关注常见遗传变异,而对低频遗传变异的研究较少。2015年,Helgason等人开展了首个欧洲人群大样本的胃癌GWAS,验证了染色体1q22、5p13.1和8q24是胃癌的易感区域,同时发现了ATM基因编码区罕见无义突变与欧洲人群胃癌易感性存在显著关联。然而,低频遗传变异在中国人群胃癌发生中的作用尚不明确,因此本研究开展了首个中国人群胃癌全外显子组关联研究。本研究采用三阶段病例-对照研究设计,在初筛阶段应用Illumina全外显子组芯片对1140例胃癌病例和1854例健康对照进行基因分型,随后对获得的分型数据进行严格质量控制,包括剔除质量不合格位点176580个(其中位于非常染色体上的位点369个、重复位点831个、MAF为0的位点174591个,分型成功率<95%位点439个、偏离Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE,P<1.00×10^-4)位点340个以及与前期GWAS芯片分型一致率低于95%的位点10个)和样本33例（其中重复或者具有一、二级亲缘关系25例、存在异常杂合度样本5例、与前期GWAS芯片分型一致率<95%的样本3例）,最终纳入1113例胃癌病例和1848例健康对照的71290个位点应用Logistic回归模型进行关联分析。针对关联结果,本研究选取P值<5×10^-3且分型可靠的21个低频（MAF<5%）错义或剪切位点,在后续共计4687例胃癌病例和5780例健康对照中进行了两阶段验证。针对成功验证的低频遗传变异,通过Mupro网站、I-Mutant2.0网站和iStable网站对其及与之存在高度LD的位点进行功能注释,预测这些遗传变异对所在基因编码蛋白稳定性的影响。基于The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库,分析易感基因在胃癌组织和癌旁组织的差异表达情况,并在此基础上通过富集分析寻找易感基因及其存在共表达关系的基因所富集的通路。最后,应用siRNA和CRISPR/Cas9方法在胃癌细胞系敲低或敲除易感基因,并通过细胞表型体外实验和裸鼠菏瘤体内实验,进一步探究了易感基因在胃癌发生中的作用。研究结果显示,位于染色体1p35.2区域SPOCD1基因上的低频错义遗传变异rs112754928（p.Arg71Trp）,在三阶段病例组中的MAF（0.7%,1.3%和1.3%）均低于对照组（1.5%,2.4%和2.2%）,与胃癌发生风险显著相关(OR=0.56,95%CI=0.46-0.69,P=3.48×10^-8)。与该位点存在高度LD的其他两个位点（rs112752591[p.Thr349Ala],r²=1.00;rs112651926[p.Gln355Arg],r²=0.99）均为SPOCD1外显子区错义突变,且生物信息学功能注释发现rs112754928和rs112752591均能够降低SPOCD1蛋白稳定性;TCGA胃癌数据库证实SPOCD1在胃癌组织中显著高表达,同时将与SPOCD1存在显著共表达关系的基因进行KEGG通路富集分析,发现这些基因主要富集于细胞外基质受体相互作用通路以及PI3K-Akt信号通路。此外,多个胃癌细胞系中SPOCD1表达水平高于胃正常上皮细胞GES1。在SPOCD1表达水平较高的BGC823和HGC27胃癌细胞系敲低SPOCD1后,发现胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著减弱;应用CRISPR/Cas9技术敲除SPOCD1后,细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型同样减弱,随后在敲除细胞系中过表达SPOCD1后,细胞恶性表型得到回复;体内裸鼠菏瘤实验证实敲除SPOCD1后,细胞成瘤能力减弱。上述研究结果表明,染色体1p35.2区域的SPOCD1可能是胃癌的易感基因,其低频错义突变可降低其蛋白功能,抑制其促癌能力,从而导致错义突变携带者的胃癌发生风险下降。这些结果揭示了低频遗传变异对胃癌发生也具有重要作用,并完善了中国人群的胃癌遗传易感图谱,新发现的胃癌易感基因SPOCD1为阐明胃癌发生机制、研发治疗靶标提供新思路。第二部分染色体5p13.1区域遗传变异调控PRKAA1影响胃癌发生的机制研究自2008年,日本人群报道了首个胃癌GWAS以来,包括本课题组在内的多个团队已系统探讨了常见遗传变异与胃癌发生的关联,并鉴定了一批影响胃癌发生风险的易感区域,包括染色体1q22、3q13.31、5p13.1、5q14.3、6p21.1、6p22.1、8q24.3、9q34.2、10q23.33、12q24.11-12和20q11.21等。然而这些位点大多位于染色体非编码区,目前位于1q22、8q24和10q23.33区域易感位点的生物学机制已被初步阐明。因此,需要进一步系统分析其他的易感区域,并通过生物功能学研究,解析这些易感区域遗传变异的功能及其在胃癌发生中的作用机制。本研究首先采用Meta分析对4项胃癌GWAS进行整合:采用Illumina芯片新检测的ONCO-GWAS（江苏地区:1140例胃癌病例和1053例对照）、本课题组已报道的NJ-GWAS（南京地区:565例病例和1162例对照）和BJ-GWAS（北京地区:468例病例和1123例对照）及另一项已报道的SX-GWAS（山西和河南地区:1625例病例和2100例对照）。首先,对单个GWAS质量不合格的位点和样本按照统一标准进行质控,以千人基因组计划（1000 Genomes）数据为参考,利用IMPUTE2软件对各个GWAS数据进行了基因型填补。填补数据质控后,应用GWAMA软件,通过固定效应模型对3771例胃癌病例和5426例健康对照的6192596个共有位点进行关联结果的meta分析。针对目前生物学易感机制仍未被阐明的5p13.1区域,通过逐步logistic回归分析方法,鉴定该易感区域内的独立效应位点;随后基于Genotype-Tissue Expression（GTEx）数据库,在正常胃组织中分析了独立效应位点与其上下游1Mb范围内所有基因表达水平间的关联;为寻找候选功能性位点,本研究通过ANNOVAR、Regulome DB和CADD等网站对独立效应位点上下游500kb范围内所有高LD位点（r²>0.6）进行功能注释和评分,并在此基础上根据Roadmap、GEO（Gene Expression Omnibus）以及Encyclopedia of DNA Elements（ENCODE）数据库中各表观修饰数据,探寻位于这些活性信号峰上的功能性位点;通过双荧光素酶报告基因实验评价了这些候选功能性位点对所在区域转录活性的影响;进一步通过EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay,凝胶阻滞迁移实验）和ChIP（Chromatin Immunoprecipitation,染色质免疫沉淀）鉴定了功能性位点能够影响结合的转录因子;对于候选易感基因,应用siRNA和CRISPR/Cas9方法在胃癌细胞系敲低或敲除该易感基因,并通过细胞表型体外实验和裸鼠菏瘤体内实验,进一步探究了易感基因在胃癌发生中的作用。研究结果验证了既往报道的10个胃癌易感区域（P<0.05）,包括染色体1q22、3q13.31、5p13.1、5q14.3、6p21.1、6p22.1、8q24.3、9q34.2、10q23.33和20q11.21区域,其中染色体1q22(rs760077,OR=0.72,P=2.09×10^-12)、5p13.1(rs6897169,OR=1.25,P=5.48×10^-12)和10q23.33(rs10509671,OR=1.34,P=2.51×10^-12)区域的关联结果达到了全基因组关联显著性水准(P<5×10^-8)。鉴于1q22和10q23.33区域易感位点的生物学机制已被初步阐明,本研究进一步对5p13.1区域进行分析显示,校正rs6897169后该区域其他遗传变异与胃癌均不存在显著关联,提示该区域仅存在唯一的独立关联信号;对该位点的表达数量性状基因座（eQTL）分析发现rs6897169的风险等位基因C,能够显著降低PRKAA1的表达水平(P=7.2×10^-4);功能注释显示,与rs6897169存在高度LD的三个遗传变异（rs3805495、rs59133000、rs10065570）位于基因组调控区,是潜在的功能性位点;报告基因实验证实,位于PRKAA1转录起始点上游677bp的rs59133000能够影响该基因的启动子活性;EMSA和ChIP证实rs59133000的风险等位基因C可以增强NFKB1结合在PRKAA1启动子的能力;CRISPR/Cas9敲除PRKAA1后,胃癌细胞的增殖能力显著增强,提示该基因在胃癌的发生中具有抑癌基因的作用。上述研究结果不仅验证了既往报道的10个胃癌易感区域,也发现了染色体5p13.1区域的功能性遗传变异rs59133000,其等位基因C通过增强NFKB1与PRKAA1启动子的结合能力,抑制启动子活性进而降低PRKAA1的表达水平,减弱了PRKAA1的抑癌基因作用,促进了胃癌的发生,最终导致C等位基因携带者胃癌发生风险增加。本研究揭示了5p13.1区域遗传变异调控PRKAA1表达影响胃癌发生的生物学机制,为将遗传变异作为生物标志物应用于胃癌高危人群筛查、促进胃癌早诊早治奠定了理论基础。