论文部分内容阅读
牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferricin,Lfcin B)是牛乳中乳铁蛋白在胃蛋白酶酸性环境水解产生的一种活性多肽,人乳铁蛋白素(Human Lactoferricin,Lfcin H)是人乳中乳铁蛋白水解产生的一种活性多肽,国内外主要研究Lfcin B的生物活性,对Lfcin H研究较少,本课题用不同质量浓度的Lfcin B和Lfcin H分别对白血病细胞Jurkat、小鼠巨噬细胞、小鼠脾淋巴细胞作用,探讨Lfcin B和LfcinH的抗肿瘤、抗炎症及免疫调节作用并比较两者的差异性和相关性,为将Lfcin开发成生物型抗肿瘤药物、婴儿配方奶粉和乳产品提供理论和实验依据。本研究采用MTT法检测Lfcin B和Lfcin H对Jurkat细胞增殖影响;Hoechst33258染色法荧光显微镜观察Jurkat细胞核的变化;运用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术将Lfcin B和Lfcin H促进Jurkat细胞凋亡的阶段进行区分;JC-1染色激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位的改变;采用Griess法测定Lfcin B和Lfcin H对LPS刺激后的小鼠巨噬细胞释放NO的含量;CCK-8法检测Lfcin B和Lfcin H单独作用对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及与丝裂原共同作用对小鼠T、B淋巴细胞增殖作用的影响;ELISA法测定巨噬细胞释放TNF-α的含量和淋巴细胞释放IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的含量。实验研究结果如下:(1)MTT结果显示Lfcin H和Lfcin B对Jurkat细胞有显著的抑制作用(P<0.05),呈剂量依赖性;经Lfcin B和Lfcin H处理后的Jurkat细胞在荧光显微镜下均可见细胞核皱缩、碎裂呈凋亡特征;激光共聚焦显微镜观察到Jurkat细胞线粒体膜电位下降;流式细胞术检测发现Jurkat细胞经Lfcin B和Lfcin H处理48 h时主要发生早期凋亡。研究结果表明100~300μg/mL的Lfcin B和Lfcin H可显著抑制Jurkat细胞增殖并诱导细胞凋亡,150μg/m L的Lfcin H和250μg/m L的Lfcin B为抑制Jurkat细胞增殖的最佳作用浓度,推断Jurkat细胞凋亡的机制可能是通过影响线粒体膜电位导致Jurkat细胞凋亡并抑制细胞增殖。(2)Griess法和CCK-8结果显示,Lfcin B和Lfcin H能显著抑制LPS刺激后的Balb/c小鼠巨噬细胞释放NO和TNF-α,呈剂量依赖性,与空白组相比具有显著差异(P<0.05)但均低于LPS对照组(1μg/mL的LPS)。100μg/m L的Lfcin H和150μg/m L的LfcinB为抑制巨噬细胞释放NO和TNF-α的最佳作用浓度,LPS活化后可以诱导巨噬细胞产生NO和促炎症细胞因子TNF-α,推测Lfcin B和Lfcin H可能是通过抑制NO的释放和促炎症细胞因子TNF-α的分泌,避免机体组织受到损伤,达到了抗炎的目的。(3)CCK-8结果显示,Lfcin B和Lfcin H能有效的促进脾淋巴细胞的增殖,并与Con A、LPS对T、B淋巴细胞的增殖有协同刺激作用,并且能显著促进小鼠脾淋巴细胞体外分泌细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α,与对照组相比具有显著差异(P<0.05),研究结果表明Lfcin B和Lfcin H质量浓度分别在为150μg/mL、100μg/m L与48 h时脾淋巴细胞的增殖效果最佳,四种细胞因子的分泌量均达到最大,推测Lfcin B和Lfcin H可能是通过促进脾淋巴细胞增殖和诱导其分泌细胞因子,从而增强机体的免疫调节功能。综上所述,本研究可以得出以下结论:Lfcin B和Lfcin H能够抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡,抑制LPS刺激后的Balb/c小鼠巨噬细胞释放NO和分泌细胞因子TNF-α。及促进Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖,调节细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的分泌水平,因此Lfcin B和Lfcin H起到了抗肿瘤、抗炎症和免疫调节作用,Lfcin B与Lfcin H在这三个功能性质上具有同等功效,只是在剂量上稍有差别,本研究为下一步的体内实验打下了良好的基础,也为来源广泛的牛乳组分替代母乳提供了实验支撑,丰富了天然抗肿瘤药物的研制工作,也为婴儿配方奶粉及免疫调节食品的开发开辟了新道路。