论文部分内容阅读
研究植物耐热分子机制的方法很多,其中筛选高温敏感突变体是一种有效的方法。至今,大量的热敏感突变体的研究表明植物热激反应是一个复杂的网络系统,涉及热激蛋白及热激转录因子、抗氧化系统、激素和钙等多个方面。 拟南芥 AtFes1基因家族包括:At3g09350(AtFes1A)、At3g53800(AtFes1B)和At5g02150(AtFes1C)。芯片数据显示 At3g09350是含量最丰富的热激响应基因,该基因编码一种受高温诱导的armadillo/beta-catenin repeat蛋白,与动物HspBP-1和酵母 Fes1p同源,但其生物学功能迄今不详。 为了研究拟南芥 AtFes1A的功能,我们从ABRC订购了该基因被敲除的T-DNA插入突变体 Salk-021784和Salk-072075。利用基因组DNA PCR和Western-blotting方法,我们对突变体进行了筛选,获得 AtFes1A基因被敲除的纯合突变体。回交实验证明突变体中T-DNA为单拷贝;通过表型分析发现,两个独立突变体5天幼苗的获得耐热性均明显下降;互补实验使得突变体耐热性恢复;这些结果充分说明 AtFes1A缺失会导致拟南芥耐热性下降。 为进一步探究AtFes1A在拟南芥中的分子机制,我们利用Northern和Western方法对突变体中相关热激响应基因的变化进行了分析,结果发现高温条件下 atfes1a突变体中Hsp70等基因热激响应较野生型更为强烈,但 Hsp70蛋白水平却明显低于野生型,因此我们推测敲除 AtFes1A导致 Hsp70在高温胁迫下发生了降解。基于Hsp70对于植物耐热的重要性,我们认为atfes1a突变体的热敏感表型就是由于Hsp70降解引起的。 免疫共沉淀实验已经证实 AtFes1A与 Hsp70能够相互作用,为进一步证实这种互作作用我们利用酵母双杂交系统进行了分析。结果发现,Hsp70在酵母体内可以正常表达,但是AtFes1A在酵母中表达异常,而转双基因酵母也不能在四缺陷培养基上生长。 此外,我们构建了AtFes1A过量表达载体并转化野生型拟南芥。研究发现,过量表达AtFes1A基因对Hsp70及Hsp101的表达均没有产生明显影响。