研究背景与意义最近的流行病学研究表明,胰腺导管腺癌是恶性程度高,致死率高,预后极差的恶性肿瘤。随着环境污染、生活节奏的加快、诊断手段的改进,胰腺癌的发病率越来越高。胰腺癌的5年生存率低于6%,且确诊后大部分患者已有远处转移,只有约20%的病人有手术机会[1,41]。多种因素导致胰腺癌患者的低生存期,其中最主要的因素是早期诊断方式的缺乏,大部分患者确诊时已经属于中晚期,85%的患者确诊时已经并发有远处转移,失去了手术切除的机会,即使手术切除5年生存率也只有25%[1,3]。尸检发现,90%胰腺癌患者并发有远处器官脏器的转移[42]。因此,研究胰腺癌的发生、发展及转移的分子机制,并研发新的早期诊断标志物成为现阶段肿瘤生物研究的热点。信号素是调节细胞分化、形态、功能以及细胞间相互作用的可溶性蛋白质家族,其主要表达于细胞质和胞膜上[6]。在哺乳动物中已经有20种信号素,并且分为五类(信号素3-7)[43]。所有的信号素都具有由约500个氨基酸组成的氨基末端sema结构域[44]。信号素semaphorin的大部分效应是由信号丛蛋白plexin介导的,信号丛蛋白是一组九个跨膜受体,可以细分为四类,丛蛋白A-D。信号素semaphorin和丛蛋白plexin广泛表达于哺乳动物体内,但是两个蛋白家族的成员通常具有特异性的表达模式。信号素-神经丛系统在发育期间和成年生物体内涉及多种作用,特别是在神经系统、免疫系统和血管生成期间[7,45-49]。在过去的10年中,对信号素神经丛蛋白在分子和细胞功能中的作用机制有一定的研究,其中许多信号素丛蛋白在特定的疾病中起着关键性的作用。阻断信号素神经丛信号传导的效应分析通常使用缺乏特定信号素或神经丛素的敲除小鼠模型,或RNA干扰技术抑制信号素或神经丛表达的动物模型[50]。目前小分子药物和各种生物制剂也已经在临床前疾病模型中开发和测试,这些最新的发现在越来越多文献中报道,主要阐明阻断或者促进信号素神经丛样信号传导以预防或治疗特定疾病的机制。在过去五年中,在信号素和神经丛蛋白的结构方面的研究也取得了一定的进展,信号素和神经丛蛋白的sema结构域之间的结合界面的研究,促进了信号素神经肽相互作用特异机制的研究。信号素和神经丛蛋白在调节肿瘤生长和转移,以及在骨转移和微血管疾病中起着中枢作用,并且能控制组织的再生,它们还在炎症、自身免疫和其他免疫性疾病中起到关键性的作用。semaphorin3s是分泌型蛋白,主要包括semaphorin3a、semaphorin3b、semaphorin3c、semaphorin3d、semaphorin3e、semaphorin3F等。其中大部分semaphorin起到抑制肿瘤生长的作用,如sema3a、sema3b、sema3e、sema3F等。研究发现sema3c在多种肿瘤组织中高表达,并起到促进肿瘤细胞生长和转移的作用,如胃癌、肝癌、乳腺癌、口腔肿瘤等[9,13,51,52]。Sema3c的表达还和胃癌、乳腺癌的预后成正相关[17,20]。在体外细胞实验的研究中发现,sema3c能促进上皮细胞的增殖、转移及卷曲形成血管,因此和肿瘤内新生血管的形成密切相关[18,53]。近期的一项研究发现,full-length sema3c能抑制肿瘤淋巴管的形成及转移。综上所述,sema3c可能在不同的肿瘤中具有不同的作用,但是其具体的分子调控机制及临床意义还有待研究。目前关于sema3c在胰腺导管腺癌中的作用及机制还没有相关文献报道。上皮间质转化(EMT),是指上皮细胞在特定的病理生理情况下向间充质细胞转化的现象。在多种肿瘤的进展过程中,EMT和肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关,其中包括肝癌、胃癌、胰腺癌等消化道肿瘤[54]。EMT时会导致相关上皮细胞标志蛋白表达的减少,而致间质细胞标志蛋白的表达增加[55]。在肿瘤的发生、发展过程中,EMT可能激活一种类似胚胎发育的过程,为细胞的迁移和转移提供能力,Herman等研究表明,在前列腺癌细胞系中过表达sema3c后,会下调两个重要的上皮细胞标志E-cadherin和α-catenin,而使细胞的侵袭能力增强。因此sema3c可能通过调控EMT促进胰腺癌的侵袭和转移。多个信号通路在EMT调节肿瘤的进展中起着重要作用,如βWnt/β-catenin、JAK/STAT3,NF-κBκ和ERK1/2信号通路。研究表明,ERK1/2信号通路在EMT诱导的肿瘤细胞迁移和侵袭过程中起着重要的作用,且在肿瘤细胞的增殖、转移以及EMT过程中也起着关键性作用[28]。在多种肿瘤中ERK1/2的磷酸化水平均增加,其中包括胰腺癌。javle等研究发现,胰腺癌中ERK1/2磷酸化的增强,以及EMT过程与患者的预后密切相关[40]。因此在胰腺癌中,ERK1/2信号通路可能参与调控EMT过程。研究目的:1.检测sema3c在胰腺癌肿瘤组织及胰腺癌细胞系中的表达情况。2.研究sema3c在胰腺癌肿瘤组织中的表达和临床的相关性,并分析其在肿瘤细胞生长和转移中的作用。3.观察sema3c是否通过调控EMT进而影响肿瘤细胞的侵袭和转移。4.探讨ERK1/2信号通路是否在sema3c调控胰腺癌细胞增殖、侵袭、转移及EMT的过程中起着一定的作用。研究方法:1.首先通过RT-PCR,q RT-PCR和Westernblot检测sema3c在胰腺癌肿瘤组织及正常胰腺组织中的表达情况,RT-PCR,q RT-PCR检测sema3c在胰腺癌细胞株As PC-1,Bx PC-3,PANC-1,CFPAC-1和Hs766T中的表达水平。通过免疫组化观察sema3c在胰腺癌肿瘤组织中的表达和定位情况,并通过统计学分析其与TNM分期、肿瘤大小、患者年龄和患者术后生存期及复发的关系。2.通过慢病毒转染干扰sema3c在胰腺癌细胞株Bx PC-3中的表达,并通过质粒转染过表达sema3c在胰腺癌细胞株CFPAC-1中的表达。转染后,通过CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖情况,同时利用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡情况。3.通过Transwell实验和划痕实验观察转染后各组细胞的侵袭和转移能力,并通过Western blot检测各组细胞中上皮细胞标志蛋白α-catenin、E-cadherin,以及间质细胞标志蛋白N-cadherin和ZEB2的表达情况。4.免疫组化检测ERK1/2在胰腺癌肿瘤组织中的磷酸化情况,并通过linear regressin方法分期其表达与sema3c表达的相关性。用ERK1/2信号通路抑制剂U0126刺激胰腺癌细胞后,用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖情况,同时利用Transwell实验检测细胞的侵袭能力,并通过Western blot检测各组细胞中上皮细胞标志蛋白α-catenin、E-cadherin,以及间质细胞标志蛋白N-cadherin和ZEB2的表达情况。5.通过NOD/SCID老鼠的成瘤实验观察sema3c在小鼠体内对胰腺癌细胞成瘤的影响。研究结果:1.Sema3c在胰腺癌肿瘤组织中的表达升高,且在不同胰腺癌细胞株中的表达水平不一致,在Bx PC-3中的表达最高,在CFPAC-1中的表达最低。2.Sema3c在胰腺癌肿瘤组织中的表达水平和TNM分期成正相关,与患者术后生存期成负相关。3.Sema3c能促进胰腺癌细胞的增殖,并抑制胰腺癌细胞的凋亡。4.Sema3c可能通过调控EMT促进胰腺癌细胞的侵袭和转移。5.Sema3c通过ERK1/2信号通路调控胰腺癌细胞增殖、侵袭及EMT。6.在小鼠体内,sema3c能够促进肿瘤的生长。研究结论:Sema 3c在胰腺癌中过表达且与临床具有一定的相关性,并通过ERK1/2信号通路调控肿瘤细胞的生长和转移。