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慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是慢性胃炎的一种类型,系指胃黏膜上皮遭受反复损害导致固有腺体的减少,伴或不伴纤维替代、肠腺化生和/或假幽门腺化生的一种慢性胃部疾病。伴有中重度上皮内瘤变(ntraepithelial neoplasia,IEN)、肠上皮化生(intestinalmetapalsia,IM)的 CAG 为胃癌前病变。与胃癌(Gastric Cancer,GC)的发展密切相关。CAG发病机制较为复杂,主要与H.pylori感染相关,此外与基因多态性、年龄、MI、饮酒、吸烟、高盐饮食等因素相关。现代医学缺乏有效治疗手段,临床实践表明中医药对其有良好疗效。本研究采用导师魏玮教授临床治疗CAG效方胃康宁配方颗粒,围绕炎症及凋亡两个机制开展动物实验,观察胃康宁颗粒干预CAG模型大鼠的疗效,探索其效应机制。实验一胃康宁颗粒剂干预慢性萎缩性胃炎模型大鼠疗效研究目的:观察胃康宁颗粒对N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)联合雷尼替丁饲料诱导CAG模型大鼠的疗效。方法:SPF级健康雄性SD大鼠100只,随机分为空白对照组(BC组),CAG造模组。BC组10只,CAG造模组90只。空白对照组给予每日5ml/kg生理盐水灌胃,正常饮食,自由饮水。CAG造模组给予每日灌胃120 μ g/mL的MNNG灌胃液,5ml/kg,0.03%雷尼替丁饲料自由食用,自由饮水。连续造模至第31周起,每2周随机抽取4只CAG造模组大鼠,进行胃黏膜病理形态组学检查,直至4只大鼠病理均示为胃黏膜固有腺体萎缩,表明造模成功。造模成功后将CAG造模组大鼠随机分为5组:模型对照组(MC组),胃康宁高剂量组(WH组),胃康宁中剂量组(WM组),胃康宁低剂量组(WL组),叶酸组(FC组)。WH组、WM组、WL组生药给药剂量分别为相当于生药的42.84g/kg/d(胃康宁高浓度灌胃液10ml/kg)、21.42g/kg/d(胃康宁中浓度灌胃液10ml/kg)、10.71g/kg/d(胃康宁低浓度灌胃液10ml/kg)。FC组予叶酸1.614mg/kg/d(叶酸片溶液10ml/kg)。BC组、MC组给予等量生理盐水。连续灌胃至第8周末处死大鼠,采集全小弯侧及近大弯侧上至食管端下至十二指肠端的胃黏膜组织,常规HE染色及AB-PAS染色。观察大鼠一般情况及胃黏膜组织病理学情况。采用SPSS 26分析数据。结果:1.大鼠一般情况:造模期间,空白组大鼠体毛顺滑浓密,毛色洁白有光泽。活动度较高,对饲养笼搬动、投喂食水等活动以及声响反应度高。精神状态佳,灌胃、称重等操作时情绪稳定。大便黄褐色成形。模型组大鼠体毛枯槁稀疏,易脱落,毛色晦暗偏米黄。活动度低,喜蜷卧,对饲养笼搬动、投喂食水等活动以及声响反应度低。精神状态萎靡,灌胃、称重等操作时容易出现情绪波动以及抓咬撕挠实验操作者行为。部分大鼠肛周污染,大便稀溏。干预结束后,MC组大鼠体毛、活动度、反应度、精神状态、情绪大便情况等较干预前未见明显改善。与MC组比较,WH组、WM组大鼠体毛较洁白顺滑,活动度较好,对饲养笼搬动、投喂食水等活动以及声响反应度有一定程度恢复,精神状态及情绪较为稳定,大便黄褐色成形;FC组大鼠大鼠体毛、活动度、反应度、精神状态、情绪等与MC组差异不明显,大便黄褐色成形;WL组大鼠大鼠体毛、活动度、反应度、精神状态、情绪大便情况等基本介于WL组、WM组及MC组之间。2.大鼠成模情况:第41周,造模组4只杀检大鼠胃黏膜组织全部出现固有腺体减少,判定为造模成功。3.大鼠死亡情况:BC组大鼠死亡1只。模型组大鼠自第31周起每周杀检4只,至第41周成模,共6次,共杀检大鼠24只。此外造模期间共死亡大鼠11只。大鼠意外死亡原因考虑为灌胃操作不当、打架撕咬、不耐受造模药物以及衰老死亡等。4.组织病理学:(1)HE染色评价:MC组与BC组对比:MC组大鼠胃黏膜HE染色的萎缩评分和总评分显著高于BC组(P<0.05),炎症、肠化、异型增生评分与BC组间无显著差异(P>0.05)。药物干预组与MC组相比:WH组、WM组大鼠胃黏膜HE染色萎缩评分及病理评分总分显著低于MC组(P<0.05),炎症、肠化、异型增生评分与MC组间无显著差异(P>0.05)。FC组和WL组大鼠胃黏膜HE染色萎缩、炎症、肠化、异型增生评分及病理评分总分与MC组间无显著差异(P>0.05)。WH组、WM组、WL组与FC组对比:WH组、WM组、WL组大鼠胃黏膜HE染色萎缩、炎症、肠化、异型增生评分及病理评分总分与FC组间无显著差异(P>0.05)。WH组、WM组、WL组间对比:WH组大鼠胃黏膜HE染色萎缩评分及病理评分总分显著低于WL组(P<0.05),炎症、肠化、异型增生评分无显著差异(P>0.05)。WM组大鼠胃黏膜HE染色萎缩、炎症、肠化、异型增生评分及病理评分总分与WH组、WL组间无显著差异(P>0.05)。(2)AB-PAS 染色:MC组与BC组对比:MC组大鼠胃黏膜组织AB-PAS染色肠化评分显著高于 BC 组(P<0.05)。药物干预组与MC组对比:WH组、WM组和FC组大鼠胃黏膜组织AB-PAS染色肠化评分显著低于于MC组(P<0.05);WL组大鼠胃黏膜组织AB-PAS染色肠化评分与MC组无显著差异(P>0.05)。WH组、WM组、WL组与FC组对比:WH组、WM组、WL组大鼠胃黏膜AB-PAS染色肠化评分与FC组间无显著差异(P>0.05)。WH组、WM组、WL组间对比:WH组、WM组、WL组大鼠胃黏膜AB-PAS染色肠化评分组间无显著差异(P>0.05)。实验二基于IL-11/JAK2胃康宁干预慢性萎缩性胃炎模型大鼠的效应机制目的:验证胃康宁是否通过IL-11/JAK2/STAT3信号通路及下游凋亡途径治疗CAG模型大鼠。方法:实验动物及造模、分组、干预方法同实验一。麻醉大鼠后各组大鼠腹主动脉取血2ml,离心,-80℃保存,Elisa法检测大鼠血清IL-11水平。摘离全胃,迅速沿大弯侧剪开,生理盐水漂洗后,取胃窦部胃黏膜组织2块,约4mm*4mm,-80℃保存,Elisa法检测各组大鼠血清白介素-11表达,Western Blot方法检测各组大鼠胃黏膜组织JAK2、STAT3、p-STAT3以及Cyclin D1表达水平,PCR法检测各组大鼠胃黏膜组织Bax、Bcl-xL、Bcl-2 mRNA表达。结果:(1)Elisa法检测血清白介素-11表达:MC组与BC组对比:MC组大鼠血清IL-11表达显著升高(P<0.05)。药物干预组与MC组对比:胃康宁高、中、低剂量组以及叶酸组大鼠血清IL-11表达均显著降低(P<0.05)。WH组、WM组、WL组与FC组对比:WH组、WM组大鼠血清IL-11表达均显著降低(P<0.05)。WH组、WM组、WL组间对比:WH组、WM组大鼠血清IL-11表达均显著低于WL组(P<0.05),WH组、WM组间大鼠血清IL-11表达无显著差异(P>0.05)。(2)Western Blot 法检测胃黏膜组织 JAK2、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1蛋白表达:MC组与BC组对比:MC组大鼠胃黏膜JAK2、STAT3和Cyclin D1表达显著升高(P<0.05);p-STAT3表达与BC组间差异无统计学意义(P>0.05)。药物干预组与MC组对比:WH组大鼠胃黏膜JAK2、Cyclin D1表达显著降低(P<0.05),STAT3以及p-STAT3表达与其差异无统计学意义(P>0.05);FC组大鼠胃黏膜Cyclin D1表达显著降低(P<0.05),JAK2、STAT3以及p-STAT3表达与其差异无统计学意义(P>0.05);WM组、WL组大鼠胃黏膜JAK2、STAT3、p-STAT3以及Cyclin D1表达与其差异无统计学意义(P>0.05)。WH组、WM组、WL组与FC组对比:WH组、WM组、WL组大鼠胃黏膜JAK2、STAT3、p-STAT3以及Cyclin D1表达与其差异无统计学意义(P>0.05)。WH组、WM组、WL组间对比:WH组大鼠胃黏膜JAK2表达显著低于低剂量组(P<0.05),STAT3、p-STAT3以及Cyclin D1表达与其差异无统计学意义(P>0.05);WH组、WM组间以及WM组、WL组间大鼠胃黏膜上述指标表达差异无统计学意义(P>0.05)。(3)PCR法检测胃黏膜组织Bax、Bcl-xL、Bcl-2 mRNA表达MC组与BC组对比:MC组大鼠胃黏膜Bcl-xL、Bcl-2 mRNA表达均显著升高(P<0.05),Bax mRNA表达显著降低(P<0.05)。药物干预组与MC组对比:FC组、WH组、WM组、WL组大鼠胃黏膜Bcl-xL、Bcl-2 mRNA表达均显著降低(P<0.05);Bax mRNA表达显著升高(P<0.05)。WH组、WM组、WL组与FC组对比:WH组、WM组大鼠胃黏膜的Bcl-xL和Bcl-2 mRNA表达显著降低(P<0.05),Bax mRNA表达与其差异无统计学意义(P>0.05)。WH组、WM组、WL组间对比:WH组大鼠胃黏膜Bcl-xL、Bcl-2 mRNA表达均显著低于WL组(P<0.05),BaxmRNA表达显著高于WL组(P<0.05);WH组大鼠胃黏膜Bcl-xL mRNA表达显著低于WM组(P<0.05),两组Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05):WM组大鼠胃黏膜Bcl-2 mRNA 表达显著低于 WL 组(P<0.05),两组 Bcl-xL mRNA 及 Bax mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)MNNG溶液灌胃联合雷尼替丁饲料自由食用方法可以成功复制CAG大鼠模型。(2)本研究以“虚、郁、滞、瘀”系统分析CAG的病机特点,并验证了以此认识为组方指导思想的胃康宁组方对CAG模型大鼠的治疗作用,证实其在改善CAG模型大鼠胃黏膜病理表现、一般情况以及提高大鼠体重、饮食水量等方面效果优于叶酸。证明胃康宁治疗CAG模型大鼠存在量效关系。(3)CAG模型大鼠存在血清IL-11及胃黏膜JAK2、STAT3、Cyclin D1蛋白、Bcl-2、Bcl-xL基因水平升高,胃黏膜Bax基因水平下降,表明CAG模型大鼠血清炎症水平升高,胃黏膜细胞凋亡水平异常,细胞周期进程紊乱。(4)胃康宁能够改善CAG模型大鼠的血清IL-11水平以及胃黏膜Cyclin D1蛋白、Bax、Bcl-2、Bcl-xL基因表达水平,表明抗炎、促凋亡、减缓细胞周期进程可能是胃康宁治疗CAG模型大鼠的作用机制。