背景骨性关节炎(osteoarthritis,OA),是一种慢性致残性疾病,其临床表现主要为关节疼痛、活动度明显下降、关节僵直、活动度下降;其病理表现主要为关节软骨退行性改变、继发性骨质及软骨下骨破坏并关节滑膜炎性增生。骨性关节炎的发病过程累及整个关节,包括软骨、软骨下骨、滑膜以及韧带。从目前研究结果看来,骨性关节炎发病相关因素包括年龄、肥胖、基因遗传、机械应力、性别、免疫等,但其具体发病机制并不十分清楚。因此,探索骨性关节炎发病过程中重要病理改变中的关键分子及其参与的重要基因调控通路,会对骨性关节炎的预防和治疗起到一定作用。滑膜是一层薄层组织,其细胞成分主要包括成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞。在正常情况下,滑膜主要通过分泌滑液对关节进行保护;而在骨性关节炎病程中,滑膜的炎性改变与骨性关节炎疾病的发生发展关系密切。同时,流行病学研究证实,骨性关节炎具有雌激素相关性。本实验以核因子κB抑制蛋白α(IκBα)为切入点,探讨雌二醇在成纤维样滑膜细胞中能够对核因子κB(NF-κB)通路产生何种作用,从而发现雌二醇在骨性关节炎成纤维样滑膜细胞中作用的机制,并对临床治疗产生指导作用。目的1.取得正常的人滑膜,分离培养成纤维样滑膜细胞,并鉴定样本细胞纯度;2.验证人成纤维样滑膜细胞中的雌激素受体β(ERβ)的表达情况;3.验证雌二醇对炎性介质诱导建模后的成纤维样滑膜细胞能否产生抗炎作用;4.明确雌二醇对成纤维样滑膜细胞产生的抗炎作用与ERβ相关性;5.明确雌二醇对成纤维样滑膜细胞中IκBα蛋白的调控作用,从而对NF-κB通路产生作用;方法1.取得正常人膝关节滑膜,采用组织块贴壁法获取原代人膝关节成纤维样成纤维样滑膜细胞;通过流式细胞学的方法对细胞纯度加以鉴定;2.采用细胞免疫荧光染色法及免疫组织化学法观察ERβ在人膝关节滑膜及成纤维样滑膜细胞中的表达情况;3.对成纤维样滑膜细胞进行分组处理:空白对照组,白细胞介素1β(IL-1β)处理组、雌二醇处理组(处理同前组并添加雌二醇共培养)、THC处理组(处理同雌二醇处理组并添加四氢大麻酚(THC)培养),利用RT-PCR法检测成纤维样滑膜细胞IL-6 RNA层面表达水平;利用western-blot法检测IL-6蛋白层面表达水平;4.分组同前,利用RT-PCR法检测成纤维样滑膜细胞IκBα及磷酸化IκBα(pIκBα)RNA层面表达水平;利用western-blot法检测IκBα以及p-IκBα蛋白层面表达水平;结果1.采用组织块贴壁法获取原代人膝关节成纤维样滑膜细胞,培养至第三代时以流式细胞学技术对细胞加以鉴定,可知样本中细胞纯度大于95%,满足后续实验要求;2.细胞免疫荧光染色及免疫组织化学法可见成纤维样滑膜细胞中广泛存在有ER-β表达;3.RT-PCR法及western-blot法检测显示:IL-1β组IL-6的mRNA和蛋白表达量均较对照组增高;雌二醇组细胞中IL-6 mRNA和蛋白表达水平均较IL-1β组下降;在THC处理组,则可见IL-6 mRNA和蛋白表达水平较雌二醇处理组升高;4.RT-PCR法及western-blot法检测显示:与对照组相比,IL-1β组IκBα蛋白水平明显下降,IκBαmRNA水平及p-IκBα蛋白水平较对照组上调;与IL-1β处理组相比,雌二醇处理组细胞中IκBα蛋白水平重新升高,与此同时,p-IκBα蛋白水平及IκBαmRNA水平再度下降;与雌二醇处理组对比,THC处理组IκBα蛋白水平下降,p-IκBα蛋白及IκBαmRNA水平升高;结论1.采用组织块贴壁法获取原代人膝关节类成纤维样滑膜细胞,在培养过程中利用巨噬细胞贴壁性能不好的特点,通过换液、传代的操作,可以良好的纯化成纤维样滑膜细胞;2.人成纤维样滑膜细胞中广泛存在有ER-β表达;3.IL-1β刺激组成纤维样滑膜细胞胞浆中IL-6表达水平上调,说明IL-1β刺激能促进成纤维样滑膜细胞释放炎性介质,模拟炎性条件。其余三组实验证明雌二醇能对在炎性环境中的成纤维样滑膜细胞起到保护作用;4.雌二醇经ER-β作用于成纤维样滑膜细胞,并抑制IκBα蛋白的磷酸化。由此我们推论,该效应可部分阻断NF-κB二聚体的入核及其后的转录调控作用,从而对成纤维样滑膜细胞发挥作用。