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目的研究叶酸(folic acid)对APP/PS1小鼠模型Aβ沉积的影响,探讨叶酸基于DNA甲基化途径对APP/PS1小鼠模型的作用机制,为研究叶酸对神经退行性疾病的作用提供科学依据。方法将6月龄雄性APP/PS1小鼠模型随机分为以下4组:AD叶酸缺乏组(folate-deficient diet plus daily gavage with water,AD+FD);AD 叶酸对照组(control diet plus daily gavage with water,AD Control);AD 叶酸补充低剂量组(control diet plus daily gavage with 120 μg/kg folic acid,AD+120μg/kg bw-d);AD叶酸补充高剂量组(control diet plus daily gavage with 600 μg/kg folic acid,AD+600μg/kg bw·d)。APP/PS 1小鼠模型同月龄野生型小鼠作为阴性对照组(control diet plus daily gavage with water,WT Control)。AD+FD 组饲以叶酸缺乏饲料,其它各组饲以对照饲料,叶酸缺乏饲料(TestDiet5T0F,叶酸0.1mg/kg饲料)及对照饲料(TestDiet57W5,叶酸2.1mg/kg饲料)购自TestDiet(美国)。AD+120μg/kgbw·d 组灌胃 120μg/kgbw·d 叶酸溶液,AD+600μg/kgbw·d 组灌胃600μg/kgbw·d叶酸溶液,其它各组灌胃双蒸水。每周称量1次体重根据体重调整灌胃量,干预60d。分别采用IMMULITE叶酸化学发光免疫试剂盒检测血清叶酸浓度;用高效液相法(HPLC)检测血浆内S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine,SAH)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)的水平;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测脑组织淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老素 1(presenilin 1,PS1)、DNA 甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)的基因表达;Western Blot检测脑组织DNMTs的蛋白表达;用甲基转移酶活性检测试剂盒检测脑组织DNMTs总活性;采用MeDIP-qPCR(甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR)检测脑组织APP、PS1基因启动子的甲基化水平;免疫组化检测脑组织β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)和PS1蛋白表达。结果叶酸干预60d后,化学免疫发光法检测血清叶酸浓度结果显示:干预前每组血清叶酸浓度处于同一个水平,干预1w后,5组之间血清叶酸水平有改变,AD+FD组血清叶酸浓度低于其它各组;AD+120μg/kgbw·d组、AD+600μg/kg bw-d组与AD Control组相比,血清叶酸水平提高(P<0.05),5组之间血清叶酸水平都维持在3个不同的水平(P<0.05)。HPLC检测结果显示:与ADControl组相比,AD+120μg/kg bw·d组和AD+600μg/kg bw·d组均显示血浆SAM浓度升高,Hcy、SAH浓度下降,SAM/SAH比值增加,差异有统计学意义(P<0.05);而AD+FD组与AD Control组相比,显示血浆SAM、SAH、Hcy浓度升高,但SAM/SAH比值减小,差异有统计学意义(P<0.05),但AD+120μg/kgbw·d组和AD+600μg/kgbw·d组相比,没有明显变化,差异无统计学意义。RT-PCR和Western Blot检测脑组织DNMTs基因和蛋白表达结果显示:与AD Control组相比,AD+120μg/kg bw.d 组和 AD+600μg/kg bwd 组 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的基因和蛋白表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);DNMT3b基因表达在AD+600μg/kgbw·d组表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);DNMT3a、DNMT3b蛋白表达在AD+600μg/kg bw·d组表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),AD+FD组与ADControl组相比,只有DNMT3b基因表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),其它DNMTs无论在基因水平还是蛋白水平表达没有明显变化,差异无统计学意义。甲基转移酶活性检测试剂盒检测脑组织DNMTs总活性结果显示:与AD Control组相比,AD+120μg/kg bw·d组和AD+6000μg/kg bw-d组DNMTs总活性增加,AD+FD组DNMTs总活性降低,差异有统计学意义(P<0.05),但 AD+120μg/kg bwd 组和 AD+600μg/kg bwd 组相比,没有明显变化,差异无统计学意义。采用MeDIP-qPCR检测脑组织APP、PS1基因启动子的甲基化水平结果显示:与AD Control组相比,AD+120μg/kg bw·d组和AD+600μg/kg bw-d组APP、PS1甲基化水平显著升高,AD+FD组甲基化水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),但 AD+120μg/kg bwd 组和 AD+600μg/kg bw·d组相比,没有明显变化,差异无统计学意义。RT-PCR检测脑组织APP、PS1基因表达结果显示:与AD Control组相比,AD+120μg/kg bw·d组和AD+600μg/kg bw·d组APP、PS1基因表达降低,AD+FD组表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),但 AD+120μg/kg bw-d 组和 AD+600μg/kg bw.d 组相比,没有明显变化,差异无统计学意义。免疫组化检测脑组织Aβ和PS1蛋白表达结果显示:与AD Control 组相比,AD+120μg/kg bwd 组和 AD+6000μg/kg bwd 组 Aβ、PS1 蛋白表达降低,AD+FD组表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。但AD+120μg/kg bw·d组和AD+6000μg/kgbw·d组相比,没有明显变化,差异无统计学意义。结论本实验结果显示:叶酸补充减少了脑组织Aβ沉积,而叶酸缺乏使脑组织Aβ沉积增加了。其可能的机制是:叶酸通过改变DNA甲基化途径中关键代谢物SAM和SAH浓度,提高甲基化潜力,增加DNMTs基因和蛋白表达,提高DNMTs活性,促进AD相关基因甲基化反应的发生,提高AD相关基因启动子甲基化水平,从而抑制基因mRNA和蛋白表达,使Aβ沉积减少。