背景肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏受到慢性炎症等多种因素损伤所致，呈现为细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)的合成大于降解，从而导致肝内ECM过度沉积的病理生理改变。肝纤维化是肝硬化发生的必经中间环节，肝硬化目前是我国肝病的常见疾病和主要死亡病因之一，其持续发展已严重危害人类健康。每年我国约有30万人死于肝硬化相关性疾病，基于以上现状，早期积极的抗纤维化治疗有可能阻止其向肝硬化发展。干预肝纤维化发展为失代偿肝硬化和肝癌，以提高生活质量和生存率，具有重要的临床意义。我们在近期研究中发现一种名为reversine的小分子药物可能够让高度分化的成熟细胞回复到脱分化的状态并具有促使细胞返老还童的功能。由此我们构想reversine能否对肝纤维化具有治疗作用？这种作用是否能通过抑制肝星状细胞(Hepatic stellatecell，HSC)的增殖并诱导其凋亡而实现？我们拟在体外检测reversine对HSC的相关作用，同时在体内验证reversine对肝纤维化模型大鼠的效果，以期明确药物效果，为其治疗肝纤维化提供实验依据。目的探讨小分子药物reversine对大鼠肝纤维化模型的影响及其作用机制。方法1.肝纤维化模型建立及B超监测：健康雄性SD大鼠采用硫代乙酰胺皮下注射建立肝纤维化模型；建模过程中进行超声弹性成像动态监测，使用声触诊组织量化技术（VTQ）来测量肝脏组织横向剪切波速度（Vs值）。建模结束，进行标本采集与保存、H&E染色、α-SMA免疫组化并应用ImageJ图像系统分析，最后进行肝脏纤维化程度综合评分。2.离体消化、密度梯度法分离大鼠原代HSC：通过离体灌注消化，Nycodenz密度梯度液分离大鼠原代HSC，荧光显微镜下观察其形态，接种培养及消化传代、最后进行α-SMA免疫荧光鉴定。3.在体外研究reversine对HSC的相关作用：多维活细胞显微镜下观察reversine体外对大鼠HSC的作用，CCK-8检测reversine对大鼠HSC的增殖的影响，酶标仪波长450nm处测定OD值，并计算刺激率。4.在体内研究reversine对肝纤维化模型大鼠的作用：健康雄性SD大鼠采用硫代乙酰胺皮下注射建立肝纤维化模型，并进行皮下注射reversine溶液250μg/kg三周进行干预；建模及治疗过程中均进行超声弹性成像动态监测，使用声触诊组织量化技术（VTQ）来测量肝脏组织横向剪切波速度（Vs值）。治疗结束，进行标本采集与保存、H&E染色、α-SMA免疫组化并应用ImageJ图像系统分析，最后进行肝脏综合评分，综合以上结果评估药效。结果1.肝纤维化模型建立及B超监测：正常组大鼠B超弹性成像Vs值为1.18±0.181，实验组大鼠B超弹性成像Vs值为2.47±0.511。肝纤维化的程度与弹性成像Vs值呈正性相关，P<0.01具有统计学意义。H&E染色显示正常组大鼠肝组织显示汇管区、肝细胞形态完整，未见明显炎性反应、变性及坏死，实验组大鼠肝组织显示正常肝小叶的结构被破坏或消失，肝组织排列紊乱，肝细胞肿胀及炎症明显，纤维桥接形成；肝纤维化免疫组化α-SMA显示正常组大鼠肝组织显示肝小叶结构清晰、并无胶原纤维增生，实验组大鼠肝组织显示肝小叶结构破坏、汇管区扩大，肝汇管区及其周围出现纤维桥接形成、可见大量棕黄色呈阳性表达的间质细胞；应用ImageJ图像系统分析，正常组含有α-SMA的面积为7.052±2.730、实验组含有α-SMA的面积为193.037±16.318；各组大鼠肝脏的病理分期：正常组大鼠肝脏均在S0期，实验组大鼠肝脏均在S2-S3期，实验组大鼠均呈现不同程度的肝纤维化。2.离体消化、密度梯度法分离大鼠原代HSC：通过离体灌注消化，Nycodenz密度梯度液成功分离出大鼠原代HSC，每只大鼠HSC的得率大约为1.2-2.0×10^7/只。观察刚分离的HSC呈圆形，胞浆中含有较多脂滴，折光性强，在荧光显微镜下观察，呈自发蓝绿色荧光。免疫细胞荧光染色显示α-SMA阳性染色达91.90%。3.在体外研究reversine对HSC的相关作用：reversine浓度25ng/ml，干预HSC10小时，可见HSC细胞形态发生改变，细胞出现皱缩、变圆、脱落，连接消失，核质浓缩。reversine以不同浓度干预HSC并加入CCK-8试剂10μl，在37℃分别温育4h，reversine25ng/ml组、reversine50ng/ml组、reversine75ng/ml组刺激率分别为8.56%、10.77%、18.31%。在reversine25ng/ml干预HSC10小时后，能较好的抑制HSC的增殖作用，且随着浓度的升高，抑制HSC的增殖作用更加明显，呈正性相关（P<0.05），差异有统计学意义。4.在体内研究reversine对肝纤维化模型大鼠的作用：正常组大鼠B超弹性成像Vs值为1.23±0.180，实验组为2.27±0.231，reversine治疗组为1.18±0.139。肝纤维化的程度与弹性成像Vs值呈正性相关，而reversine治疗组Vs值明显小于实验组，P<0.01具有统计学意义。H&E染色显示治疗组肝组织显示汇管区出现纤维组织增生较实验组明显减少，肝假小叶周围出现胶原纤维也有所减少，肝索排列混乱有所改善，肝细胞肿胀减轻，未见明显灶性坏死。免疫组化α-SMA显示治疗组的肝小叶结构破坏有所修复，汇管区缩小，可见不完整的淡黄棕色的间质细胞。应用ImageJ图像系统分析，正常组含有α-SMA的面积为20.196±5.835，实验组含有α-SMA的面积为189.636±28.322，治疗组含有α-SMA的面积为72.195±25.141。治疗组与实验组比较，肝星状细胞的表达显著减少（P<0.01），差异有统计学意义。各组大鼠肝脏的病理分期：正常组大鼠肝脏均在S0期，实验组大鼠肝脏均在S2-S3期，经reversine治疗后，治疗组大鼠肝脏均降期在S1期。结论1.我们在B超弹性成像动态监测下，利用硫代乙酰胺成功建立了大鼠肝纤维化模型。在该模型中，肝脏中肝星状细胞的含量明显较正常肝脏的含量增多的。2.通过对大鼠的肝脏采用原位灌注消化法和Nycodenz密度梯度离心法，成功分离出大鼠原代HSC。3. reversine在细胞体外，对HSC增殖有明确的抑制作用。reversine在25ng/ml作用10小时，开始达到最佳抑制效果，使HSC细胞出现皱缩、变圆、脱落，表现出细胞凋亡的形态改变。4. reversine可在大鼠肝纤维化模型中，可通过降低肝纤维化中升高的α-SMA的表达，抑制了纤维化肝脏中HSC的活化，达到减少肝纤维化程度的结果。reversine体内抑制肝星状细胞的结果与细胞体外结果相一致。