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目的：钠通道SCN1A基因与癫痫密切相关，其表达水平异常导致癫痫，尤其是Dravet综合征。mRNA3′非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)在基因表达的转录后水平调控中发挥重要作用，3′UTR功能异常可影响基因的表达，导致疾病发生。本研究通过对SCN1A基因3′UTR功能分析来鉴定其转录后调控元件，并对癫痫患者SCN1A基因3′UTR进行变异位点筛查，分析3′UTR突变与癫痫的相关性。该研究将有助于认识SCN1A基因的转录后调控机理及癫痫发病机制，具有重要的理论意义和应用价值。 方法：⑴对来自同一基因簇的中枢神经系统表达的钠通道SCN1A、SCN2A和SCN3A基因，采用Vector NTI软件对其3′UTR进行保守性分析。⑵双荧光素酶报告基因系统检测保守序列对报告基因表达的影响。⑶生物素标记保守序列作为RNA探针，与HEK-293细胞质蛋白进行RNA电泳迁移阻滞实验(RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay, RNA-EMSA)。⑷Biotin-Pull down及SDS-PAGE电泳分离与RNA探针结合的HEK-293细胞质蛋白，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析RNA结合蛋白。加入蛋白抗体进行SuperShift实验进一步鉴定RNA结合蛋白。⑸shRNA体外干扰实验证实RNA结合蛋白的转录后调控作用。⑹对SCN1A基因外显子区及启动子区未发现异常的Dravet综合征患者， PCR扩增其钠通道SCN1A基因3′UTR，PCR产物直接测序，鉴定钠通道SCN1A基因3′UTR变异位点。对变异位点进行保守性分析及RNA二级结构预测(RNA二级结构预测软件RNAfold: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)。⑺双荧光素酶报告基因系统检测突变位点对报告基因表达的影响。⑻荧光定量PCR检测突变位点对报告基因mRNA稳定性的影响。⑼RNA-EMSA分析突变位点对UTR序列与细胞质蛋白结合的影响。⑽Biotin-Pull down及SDS-PAGE电泳分离与RNA探针结合的HEK-293细胞质蛋白，LC-MS/MS分析RNA结合蛋白。结合蛋白EMSA进一步证实。 结果：①保守性分析发现SCN1A、SCN2A和SCN3A基因3′UTR存在9个共同保守区，分别命名为CS1至CS9。②双荧光素酶活性检测结果显示，9个保守区分别敲除后，与敲除前比， SCN1A基因3′UTR的双荧光素酶报告基因表达质粒在HEK-293细胞中的相对荧光素酶活性均上升（P<0.01)，9个保守区均负性调控报告基因的表达。③保守序列探针与HEK293细胞质蛋白进行RNA-EMSA实验，发现CS2、CS5、CS6和CS9存在细胞质蛋白特异性结合，CS2、CS5、CS6和CS9是结合蛋白的调控元件。④Biotin-Pull down及SDS-PAGE分别分离CS2、CS5、CS6和CS9的结合蛋白各得到一条蛋白条带。LC-MS/MS分析蛋白条带可能是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)及苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase2, MDH2)。与相应的蛋白抗体进SuperShift实验，结果证实，CS2的结合蛋白为GAPDH，CS5、CS6和CS9的结合蛋白是MDH2。⑤GAPDH、MDH2 shRNA沉默表达质粒干扰HEK-293细胞内源性的GAPDH、MDH2表达后，与对照shRNA比， SCN1A基因3′UTR的双荧光素酶报告基因表达质粒相对荧光素酶活性上升(P<0.01)。GAPDH、MDH2表达下调可导致报告基因表达增强。⑥在24例Dravet综合征患者中发现1例患者钠通道SCN1A基因3′UTR杂合突变(c.*1794C>T)，突变来自其母亲。突变位点物种间保守性分析结果显示高度保守，RNA二级结构预测发现，该突变位点显著改变RNA二级结构。⑦双荧光素酶检测结果，与野生型1794C的SCN1A基因3′UTR的双荧光素酶报告基因表达质粒比，突变型1794T的SCN1A基因3′UTR的双荧光素酶报告基因表达质粒在HEK-293细胞系中的相对荧光素酶活性下降低约15％(P<0.01)，突变位点负性调控报告基因表达。mRNA稳定性检测发现，在HEK-293细胞系中，与野生型质粒相比，突变型质粒报告基因 mRNA半衰期缩短，突变导致报告基因mRNA稳定性降低。RNA-EMSA实验发现，带有1794U的突变型RNA探针可见特异性阻滞条带，而1794C的野生型RNA探针未见阻滞条带，突变提高SCN1A基因3′UTR与HEK-293细胞质蛋白结合能力。⑧Biotin-Pull down及SDS-PAGE分别分离结合蛋白得到一条蛋白条带。LC-MS/MS分析蛋白条带可能是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。采用纯化的GAPDH蛋白做RNA-EMSA实验发现突变型探针存在特异性阻滞条带，证实此结合蛋白为GAPDH。 结论：⑴RNA结合蛋白GAPDH及MDH2通过与SCN1A基因3′UTR调控元件结合，下调报告基因表达。提示GAPDH及MDH2可能与SCN1A基因3′UTR调控元件结合，在转录后水平负性调控SCN1A基因表达。⑵SCN1A、SCN2A和SCN3A基因3′UTR存在共同保守区，提示SCN1A、SCN2A和SCN3A基因有共同的转录后调控机制。⑶GAPDH通过与含突变（c.*1794C>T）的SCN1A基因3′UTR结合，影响报告基因 mRNA的稳定性，从而下调报告基因的表达。提示该突变位点很可能在转录后水平上异常调控SCN1A基因表达，从而导致疾病发生。