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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种以母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为典型特征的免疫抑制性疾病,其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）。PRRSV是单股正链RNA病毒,基因组变异速度快,传统疫苗对不同PRRSV毒株的交叉保护较差,从而导致PRRSV防控困难。本课题组前期研究发现,通城猪对PRRSV的易感性比大白猪低,表现在PRRSV感染后组织病变程度较轻,血清中病毒载量显著低于大白猪,抗病毒细胞因子干扰素γ（Interferon-gamma,IFN-γ）显著高于大白猪。为此,本课题组前期利用通城猪和大白猪进行PRRSV人工感染试验,在进行临床症状观察记录、细胞因子检测、组织病理学研究、样品收集的基础上,进一步开展肺泡巨噬细胞（Porcine Alveolar Macrophage,PAM）的转录组测序和小RNA测序（small RNA-seq）,以研究在两品种间和品种内感染组与对照组的差异表达m RNA和非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）。nc RNA分为管家RNA和调节RNA两大类,后者包括短的nc RNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）,其中micro RNA（mi RNA）在转录后水平调节靶基因的表达,基因间区lnc RNA（long intergenic non-coding RNA,linc RNA）参与了免疫细胞的发育和免疫应答过程,能调控病毒的增殖。本研究拟通过对通城猪和大白猪感染组和对照组PAM细胞的mi RNA测序和转录组测序数据进行分析,以研究在PRRSV感染中宿主mi RNA和linc RNA对病毒增殖的调控作用,为探索宿主和PRRSV的互作机制以及揭示通城猪的抗病机理奠定基础。以5周龄健康断奶仔猪通城猪和大白猪各6头为试验动物,按照同胞关系随机分为对照组和PRRSV感染组,感染后第7天分离PAM细胞,提取总RNA进行转录组测序和小RNA测序。主要研究内容和结果如下:1.通城猪和大白猪PRRSV感染前后PAM细胞中差异表达mi RNA的分析1.1测序数据产出及质量:构建12个小RNA文库,进行读长为50bp的单末端测序。所有文库测序得到的原始reads数均超过10M,Q30＞94%,对原始序列进行一系列过滤,得到98%以上的高质量clean reads。将长度过滤后的clean reads与参考序列比对,共筛选到250个已知的mi RNAs和50个新的mi RNAs。1.2差异表达mi RNA分析:利用SARTools包,以log2FC≥1或≤-1且p value＜0.05为阈值,筛选差异表达mi RNA。与大白猪的对照组相比,通城猪对照组中2个mi RNAs显著低表达,29个mi RNAs显著高表达;通城猪感染组与对照组相比,12个mi RNAs显著下调表达,23个mi RNAs显著上调表达;大白猪感染组与对照组相比,44个mi RNAs下调表达,67个mi RNAs上调表达;通城猪感染组中8个mi RNAs的表达显著低于大白猪感染组,22个mi RNAs的表达显著高于大白猪感染组。在已报道能抑制PRRSV复制的mi RNA中,mi R-181在两品种感染前后均存在差异表达,通过靶向病毒基因组和受体参与两品种抗PRRSV的免疫应答;mi R-378和mi R-10a-5p在通城猪中本底表达水平显著高于大白猪,可能参与了通城猪抗PRRSV的调控。随机选择7个差异表达的已知mi RNAs和1个预测的新mi RNA进行Q-PCR验证,验证率为87.5%。1.3差异表达mi RNA靶基因分析:利用mi Randa软件进行差异表达mi RNA靶向PRRSV基因组、PRRSV受体和宿主其他基因的分析。在两品种感染前后共有差异表达的mi RNA中,23个mi RNAs在PRRSV基因组上有结合位点,通城猪特异差异表达的4个mi RNAs预测到了10个结合位点。另外,mi R-1343、mi R-296-3p、mi R-199a-3p和mi R-34c能靶向PRRSV受体CD151,mi R-181a和mi R-181b能靶向结合CD163,mi R-34c能靶向CD209,它们在两品种内感染组与对照组均差异表达。与差异表达m RNA进行联合分析,发现通城猪感染前后差异表达mi RNA的靶基因显著富集到43个GO生物学过程和13个KEGG通路,大白猪感染前后差异表达mi RNA的靶基因显著富集到141个GO生物学过程和16个KEGG通路,其中下调表达mi RNA的靶基因通过参与免疫相关的生物学过程和通路调控PRRSV的增殖,包括细胞凋亡、炎症反应等生物学过程以及T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用等KEGG通路。差异表达mi RNA能调控多个免疫抑制性受体及配体基因的表达,参与了免疫抑制通路,并且它们在品种间存在差异,分析表明通城猪PRRSV感染后免疫抑制程度低于大白猪。2.通城猪和大白猪PRRSV感染前后PAM细胞中差异表达linc RNA的分析2.1测序数据产出及linc RNA特征分析:构建12个链特异性c DNA文库,进行读长100bp的双末端测序,文库的Q30＞87%,clean reads比例超过89%,每个文库的有效测序量都大于11G。经过Tophat比对参考基因组和Cufflinks拼接后共得到156033条转录本,从外显子个数、编码潜能、长度、表达水平、与数据库注释基因比对等五个方面进行过滤,鉴定了616个linc RNAs转录本。与蛋白编码基因相比,linc RNA外显子个数较少、编码潜能和表达水平都较低。2.2差异表达linc RNA的分析:利用Cuffdiff软件,以log2FC≥1或≤-1且p value＜0.05为阈值,筛选差异表达linc RNA。与大白猪的对照组相比,通城猪中10个linc RNAs显著低表达,6个linc RNAs显著高表达;通城猪感染组与对照组相比,11个linc RNAs显著下调表达,19个linc RNAs显著上调表达;大白猪感染组与对照组相比,29个linc RNAs下调表达,19个linc RNAs上调表达。通城猪感染组中8个linc RNAs的表达显著低于大白猪,27个linc RNAs的表达显著高于大白猪。随机挑选12个差异表达的linc RNA进行Q-PCR验证,验证率为91.7%。利用RT-PCR方法检测5个差异表达linc RNAs在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、睾丸和PAM细胞中的表达水平,发现所选的linc RNA在免疫器官和组织中的表达量较高,其中TCONS＿00074289仅在PAM细胞和肺中表达。2.3差异表达linc RNA靶基因分析:在差异表达linc RNA上下游500kb内发现了150个差异表达的m RNAs,富集在信号转导的调控以及繁殖相关的生物学过程。通过计算差异表达linc RNA与m RNA的Pearson相关系数,发现了915个与linc RNA共表达的m RNA,富集在多个与免疫相关的生物学过程。品种内感染组与对照组差异表达的linc RNA靶基因富集的生物学过程和KEGG通路类型相似,但通城猪在肿瘤坏死因子介导的信号通路富集,对应的linc RNA-m RNA为:TCONS＿00061823-KRT8,TCONS＿00092798-KRT18,这两个linc RNA可能参与了病毒的清除。3.通城猪和大白猪PRRSV感染前后PAM细胞中差异表达linc RNA与mi RNA的联合分析基于mi RNA与靶m RNA和靶linc RNA的序列互补及表达负相关,并结合m RNA-linc RNA共表达的关系,分析通城猪中linc RNA-mi RNA-m RNA之间的调控网络,发现TCONS＿00125566位于调控网络的核心位置,能竞争性结合mi R-1343,调控CCR5、DUSP4、CXCR3等免疫相关基因的表达,在整个调控网络中发挥重要作用。TCONS＿00125566和mi R-1343在大白猪感染前后也存在差异表达,它们可能参与了两品种PRRSV感染过程的调控。