p53是维护基因组稳定、参与细胞应激反应的主要因子。在内外源性损伤或癌基因激活时,p53被激活以应答DNA损伤并根据损伤的严重程度决定细胞的命运。p53能阻滞细胞周期进程以修复损伤,对不可修复的损伤p53诱导其凋亡。p53是一个至关重要的抑癌基因。超过50%的肿瘤有TP53突变。MSCs因其免疫原性低和多潜能分化而被广泛应用于损伤治疗,如人的骨、软骨、心血管、神经系统、皮肤等,以及本课题组将其应用于大鼠的脊髓、胰腺和皮肤损伤及肝移植,甚至用于小鼠的辐射损伤。前期研究证实MSCs可降低辐射诱导的小鼠胸腺瘤的发生率。虽然人们对MSCs参与损伤修复的机制进行了大量的研究,但详细机制仍然不清楚。因此本研究以p53为切入点从表观遗传学及p53突变和信号传递等方面探讨MSCs对辐射损伤的修复作用及其机制。方法:1、小鼠胸腺瘤模型制备选取C57BL/6J小鼠,分为正常组和照射组。根据Kaplan经典方法,用X射线全身照射方法建立胸腺瘤模型,每周照射一次,每次1.75Gy全身照射,剂量率300c Gy/s,共照射4次,总剂量为7Gy。再将照射组分为单纯照射组和MSCs干预的照射组。每天观察小鼠状态,6个月后鉴定胸腺瘤。2、MSCs分离、培养及鉴定应用全骨髓贴壁培养方法分离、纯化MSCs。选取C57BL/6J乳鼠,脱臼处死后无菌分离出股骨,去除干骺端,用L-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔。制备单细胞悬液,调整细胞浓度为2.0×105/ml并接种于25cm2底面积的培养瓶中,加入含10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液,放于37℃、5%的CO2培养箱中培养。48h后换液去除未贴壁的细胞,每天观察细胞生长情况,每周换液2次。待细胞密度达80%~90%时传代。并对MSCs进行诱导分化鉴定。取传至第3代的MSCs细胞,调整细胞浓度为5.0×105/ml并接种于铺有盖玻片的6孔细胞培养板中,2ml/孔。向培养板内加入成骨诱导液(L-DMEM培养液、20%胎牛血清、10mmolβ-甘油磷酸钠,10mol地塞米松,50μg/m L抗坏血酸)和脂肪诱导培养液(10mg/L重组人胰岛素、0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、100μmol/L吲哚美辛)培养,每日观察细胞变化,2周后进行碱性磷酸酶染色和油红O染色。3、MSCs注射受照射小鼠取细胞浓度为2×106/ml的MSCs 0.2ml,于第4次照射后当天或者第二天尾静脉注射,一周后第二次注射,共注射2次。4、免疫组化检测p53的表达取石蜡包埋的小鼠胸腺组织,切片,脱蜡后进行抗原修复。滴加1:300稀释的兔抗小鼠p53抗体,4℃过夜。PBS洗涤后滴加生物素标记的羊抗兔抗体,室温孵育20min,滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶,室温孵育20min。DAB显色,复染,梯度乙醇脱水、二甲苯透明,封片。5、RT-PCR检测基因表达量的变化应用EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取小鼠胸腺组织RNA,应用小鼠p53及相关基因的特异引物进行RT-PCR,反应条件为:94℃1 min;94℃30 s,55~65℃30s,72℃30s,30个循环;72℃5min。PCR产物经1%~2%的琼脂糖胶电泳鉴定。6、p53启动子甲基化检测及分析应用组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取胸腺基因组DNA,再用EZ DNA Methylation-Gold Kit对基因组DNA进行亚硫酸盐处理后,应用甲基化特异引物检测p53启动子甲基化,并用甲基化测序引物扩增p53启动子、测序。PCR反应条件:94℃1 min;94℃30 s,55~65℃30s,72℃30s,30个循环;72℃5min。PCR产物经1.5%的琼脂糖胶电泳鉴定。7、目的基因测序及分析经琼脂糖胶电泳鉴定正确的PCR产物,应用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收、纯化后,与TA载体p MD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经氨苄抗性筛选,挑取单克隆扩增培养,用质粒小量快速提取试剂盒提取质粒,并用Bam HⅠ(或Eco RⅠ)和HindⅢ双酶切鉴定,再选取阳性重组质粒测序。对所测得的序列经BLAST分析,判断是否是目标基因,再应用Clustal W软件比对分析。结果:1、小鼠MSCs的培养及鉴定采用全骨髓贴壁法培养C57BL/6J乳鼠骨髓MSCs,接种48h后,镜下可见细胞开始贴壁,体积较小,主要呈圆形;72h后贴壁细胞开始出现梭型,呈成纤维样生长;10天左右细胞密度可达80%~90%,形态主要是成纤维样。经传代后,圆形细胞逐渐消失,细胞均呈梭型,似鱼群样或铺路石样排列生长。对MSCs进行成骨、成脂诱导分化,结果显示,成骨诱导的MSCs碱性磷酸酶染色深,细胞形成聚集体,未诱导组则没有。成脂诱导的MSCs胞浆内出现脂滴,随着培养时间的延长,脂滴逐渐增多。表明MSCs可诱导分化成骨和脂肪。2、病理学检测分析小鼠胸腺结构解剖X射线照射后6个月的C57BL/6J小鼠,肉眼观察可见单纯照射组小鼠胸腺明显大于正常对照,无胸腺正常结构,呈淡黄色;MSCs干预的照射组小鼠胸腺大小接近正常对照组,无正常小鼠胸腺的分叶结构,颜色介于正常对照组和单纯照射组之间。胸腺组织病理切片后,光镜下观察可见对照组小鼠胸腺组织结构正常,皮髓质结构清晰,以淋巴细胞为主,淋巴细胞形态规则,大小均一,呈圆形或椭圆形。照射组小鼠正常胸腺结构被破坏,未见正常淋巴细胞,淋巴样肿瘤细胞弥漫分布,呈典型的淋巴瘤特征性细胞,有坏死碎屑,表明辐射诱导胸腺瘤形成。MSCs干预的照射组可见小鼠胸腺结构,淋巴细胞趋于正常,未见淋巴瘤特征性细胞。3、MSCs上调受照射的小鼠胸腺组织p53蛋白和m RNA的表达量免疫组化和RT-PCR检测结果显示,单纯照射组胸腺瘤组织p53蛋白和m RNA的表达量高于正常对照组(t=3.73、p=0.02和t=18.768、p<0.001),而MSCs干预的受照射小鼠未成瘤的胸腺组织p53蛋白和m RNA的表达量高于单纯照射组(t=3.065、p=0.037和t=5.801、p=0.004)。4、分析MSCs影响辐射诱导的小鼠胸腺组织p53启动子甲基化琼脂糖凝胶电泳显示正常对照组、单纯照射组、MSCs干预的照射组均未扩增出甲基化条带。亚硫酸盐测序法分析显示,正常组三例胸腺组织p53启动子均未发生甲基化。单纯照射组三例中有一例发生甲基化,在第一外显子+143位点、启动子远端-1190位点。这二个位点不在已报道的转录因子结合的基序内。但是应用Matlnspector Professional Database(www.genomatix.de/)分析结果显示,-1190位点位于转录因子E2A结合的基序内。MSCs干预的受照射小鼠未成瘤的胸腺组织三例中有一例发生甲基化,分别在第一外显子+198位点、启动子远端-1043、-1090、-1158位点,其中+198位于转录因子Pax结合基序(+195/+201)内,-1043和-1090分别位于负调控区-1065/-1084两侧。5、MSCs影响受照射小鼠胸腺p53基因突变根据C57BL/6J小鼠p53 m RNA的CDS区设计引物,扩增获得小鼠胸腺p53基因,克隆测序。每只鼠选取10个重组质粒测序,将所测的序列经BLAST分析,去除非小鼠p53基因后,转换成氨基酸序列,应用Clustal W软件比对分析。结果显示,单纯照射组p53氨基酸突变位点多,同一只鼠的不同克隆的p53突变位点不同,不同鼠的突变位点多数也不相同,且突变多集中于外显子4、5、6、7、8,突变率为78%。而MSCs干预的照射组p53氨基酸突变位点明显减少,突变率为48%。6、MSCs影响p53信号通路相关基因的表达(1)MSCs对p53上游因子的影响RT-PCR检测p53上游因子m RNA水平的结果显示,与正常对照组对比,单纯照射组Chk2的表达量下降(t=0.317,p=0.767);p53的负反馈调节因子Mdm2的表达量升高(t=5.514,p=0.005),而其调节因子p19也增加(t=2.424,p=0.072)。与单纯照射组对比,MSCs干预的照射组,Chk2的表达量明显减少(t=4.386,p=0.012);p53的抑制因子Mdm2的表达量显著下降(t=13.833,p<0.001),p19的表达量下调(t=1.352,p=0.248)。此外p53的其他调节因子如DNMT1经照射后其表达量明显减少(t=19.356,p<0.001),MSCs干预的照射组其表达量增加(t=3.302,p=0.030)。(2)MSCs对p53靶因子的影响RT-PCR检测结果显示,与正常对照组对比,单纯照射组p53重要的靶基因p21 m RNA的表达量增加(t=0.227,p=0.831),另一调控细胞周期的CDC25c m RNA的表达量也上调(t=10.505,p<0.001);凋亡基因Bax、Fas和损伤修复基因DDB2的表达量却下降(t=5.101、p=0.007,t=0.330、p=0.758和t=4.296、p=0.013),而修复基因DDIT4、GADD45αm RNA的表达量增加(t=1.912、p=0.128和t=3.631、p=0.022)。与单纯照射组对比,MSCs干预的照射组p21和CDC25c m RNA的表达量减少(t=1.833、p=0.141和t=2.995、p=0.040),而凋亡基因Bax和Fas的m RNA表达量上调(t=3.648、p=0.022和t=0.988、p=0.379),修复蛋白DDB2、DDIT4、GADD45α的m RNA表示量均下调(t=6.137、p=0.004,t=2.617、p=0.059和t=3.687、p=0.021)。结论:1、MSCs上调受照射的小鼠胸腺组织p53蛋白和m RNA的表达量。2、MSCs可增加辐射损伤小鼠胸腺p53启动子甲基化,影响负调控因子的结合,从而增加p53的表达。3、MSCs可保护或修复辐射造成的p53氨基酸的突变,使突变率由单纯照射组的78%下降至48%,使行使正常功能的p53蛋白增多。4、MSCs可下调Mdm2的表达,减少Mdm2对p53的降解,使p53的表达量增加。5、MSCs通过减少p53靶基因p21、CDC25c m RNA的表达以解除细胞周期阻滞。6、MSCs通过下调p53靶基因DDB2、DDIT4和GADD45α的表达、上调p53靶基因Bax和Fas的表达使不能修复损伤DNA的细胞凋亡。